Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Die genaue Verteilung der Lipide zwischen verschiedenen Membranen und innerhalb der Membranen eukaryotischer Zellen^1,2 hat tiefgreifende biologische Implikationen. Die Entschlüsselung der Funktionsweise von LTPs ist ein wichtiges Thema in der Zellbiologie^3,4,5,6, und In-vitro-Ansätze sind von großem Wert, um dieses Problem anzugehen^7,8,9,10,11. Hier wird eine in vitro, fluoreszenzbasierte Strategie vorgestellt, die maßgeblich dazu beigetragen hat, dass mehrere ORP/Osh-Proteine den PS/PI(4)P-Austausch zwischen Zellmembranen¹² bewirken und damit eine neue Klasse von LTPs darstellen. PS ist ein anionisches Glycerophospholipid, das 2-10% der gesamten Membranlipide in eukaryotischen Zellen ausmacht^13,14,16. Es ist entlang eines Gradienten zwischen dem ER und dem PM verteilt, wo es 5-7% und bis zu 30% der Glycerophospholipide bzw.^17,18,19darstellt. Darüber hinaus ist PS im Wesentlichen in der zytosolischen Packungsbeilage des PM konzentriert. Dieser Aufbau und die ungleichmäßige Aufteilung von PS im PM sind entscheidend für zelluläre Signalisierungsprozesse¹⁹. Aufgrund der negativen Ladung von PS-Molekülen ist das zytosolische Blättchen des PM viel anionischer als das zytosolische Blättchen anderer Organellen^1,2,19,20. Dies ermöglicht die Rekrutierung von Signalproteinen wie myristoyliertem Alanin-reichem C-Kinase-Substrat (MARCKS)²¹, Sarkom (Src)²², Kirsten-Ratten-Sarkom-Viralonkogen (K-Ras)²³und Ras-verwandtem C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1)^24, die einen Abschnitt positiv geladener Aminosäuren und einen lipidischen Schwanz enthalten.

PS wird auch von der herkömmlichen Proteinkinase C stereoselektiv über eine C2-Domäne²⁵erkannt. PS wird jedoch im ER²⁶synthetisiert, was darauf hinweist, dass es in den PM exportiert werden muss, bevor es seine Rolle spielen kann. Es war nicht bekannt, wie dies erreicht wurde¹⁹ bis zu der Feststellung, dass in Hefe, Osh6p und Osh7p PS von der Notaufnahme auf die PM²⁷übertragen. Diese LTPs gehören zu einer evolutionär konservierten Familie in Eukaryoten, deren Gründungsmitglied OSBP ist und die Proteine (ORPs im Menschen, Osch-Proteine in Hefe) enthält, die eine OSBP-verwandte Domäne (ORD) mit einer Tasche integrieren, um ein Lipidmolekül zu beherbergen. Osh6p und Osh7p bestehen nur aus einem ORD, dessen strukturelle Merkmale angepasst sind, um PS spezifisch zu binden und zwischen Membranen zu übertragen. Dennoch war unklar, wie diese Proteine PS richtungsweisend von der ER auf die PM übertragen. Osh6p und Osh7p können PI(4)P als alternativen Lipidliganden¹²einfangen. In Hefe wird PI(4)P aus Phosphatidylinositol (PI) im Golgi und im PM durch PI 4-Kinasen, Pik1p bzw. Stt4p synthetisiert. Im Gegensatz dazu gibt es kein PI(4)P in der ER-Membran, da dieses Lipid durch die Sac1p-Phosphatase zu PI hydrolysiert wird. Daher existiert sowohl an der ER/Golgi- als auch an der ER/PM-Schnittstelle ein PI(4)P-Gradient. Osh6p und Osh7p übertragen PS von der ER zum PM über PS/PI(4)P-Austauschzyklen unter Verwendung des PI(4)P-Gradienten, der zwischen diesen beiden Membranen besteht¹².

Innerhalb eines Zyklus extrahiert Osh6p PS aus der ER, tauscht PS gegen PI(4)P am PM aus und überträgt PI(4)P zurück in die ER, um ein anderes PS-Molekül zu extrahieren. Osh6p/Osh7p interagieren mit Ist2p²⁸, einem der wenigen Proteine, die die ER-Membran und das PM in unmittelbarer Nähe zueinander verbinden und bringen, um ER-PM-Kontaktstellen in Hefe^29,30,31zu erzeugen . Darüber hinaus wird die Assoziation von Osh6p mit negativ geladenen Membranen schwach, sobald das Protein einen seiner Lipidliganden aufgrund einer Konformationsänderung extrahiert, die seine elektrostatischen Eigenschaften modifiziert³². Dies unterstützt Osh6p, indem es die Verweilzeit seiner Membran verkürzt und dadurch die Effizienz seiner Lipidtransferaktivität aufrechterhält. In Kombination mit der Bindung an Ist2p könnte dieser Mechanismus es Osh6p/7p ermöglichen, den Lipidaustausch an der ER/PM-Schnittstelle schnell und präzise auszuführen. In menschlichen Zellen führen ORP5- und ORP8-Proteine den PS/PI(4)P-Austausch an ER-PM-Kontaktstellen über unterschiedliche Mechanismen^{aus 33}. Sie haben eine zentrale ORD, ähnlich Osh6p, sind aber über ein C-terminales Transmembransegment³³ direkt an der ER verankert und docken über eine N-terminale Pleckstrin-Homologie (PH)-Domäne, die PI(4)P und PI(4,5)P₂^{33,34, 35erkennt,}an den PM an. ORP5/8 verwendet PI(4)P zur Übertragung von PS, und es wurde gezeigt, dass ORP5/8 zusätzlich PM PI(4,5)P_2-Pegel reguliert und vermutlich Signalwege moduliert. Im Gegenzug senkt eine Abnahme der PI(4)P- und PI(4,5)P2-Spiegel die ORP5/ORP8-Aktivität, da diese Proteine PIP-abhängig mit dem PM assoziiert werden. Eine ungewöhnlich hohe PS-Synthese, die zum Lenz-Majewski-Syndrom führt, beeinflusst die PI(4)P-Spiegel durch ORP5/8³⁶. Wenn die Aktivität beider Proteine blockiert wird, wird PS am PM weniger reichlich, was die onkogene Fähigkeit von Signalproteinen verringert³⁷.

Umgekehrt scheint die ORP5-Überexpression die Invasion von Krebszellen und metastatische Prozesse zu fördern³⁸. So können Veränderungen der ORP5/8-Aktivität das zelluläre Verhalten durch Veränderungen der Lipid-Homöostase stark verändern. Darüber hinaus besetzen ORP5 und ORP8 ER-Mitochondrien-Kontaktstellen und erhalten einige mitochondriale Funktionen, möglicherweise durch die Versorgung mit PS^39. Darüber hinaus lokalisiert ORP5 auf ER-Lipid-Tröpfchenkontaktstellen, um PS an Lipidtröpfchen per PS/PI(4)P-Austausch⁴⁰zu liefern. Die hierin beschriebene Strategie zur Messung (i) der PS- und PI(4)P-Extraktion aus Liposomen und (ii) des PS- und PI(4)P-Transports zwischen Liposomen wurde entwickelt, um die PS/PI(4)P-Austauschaktivität von Osh6p/Osh7p^12,32 zu ermitteln und zu analysieren, und von anderen Gruppen zur Analyse der Aktivität von ORP5/ORP8³⁵ und anderen LTPs^{10verwendet. ( 41}) DER PRÄSIDENT. – Nach der 41 Es basiert auf der Verwendung eines Fluoreszenzplattenlesers, eines Standard-L-Format-Spektrofluorometers und zweier Fluoreszenzsensoren, NBD-C2_Lact und NBD-PH_FAPP, die PS bzw. PI(4)P detektieren können.

NBD-C2_Lact entspricht der C2-Domäne des Glykoproteins Lactadherin, das überarbeitet wurde, um ein einzigartiges lösungsmittelexponiertes Cystein in der Nähe der vermuteten PS-Bindungsstelle aufzunehmen; ein polaritätsempfindliches NBD-Fluorophor (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) ist kovalent mit diesem Rückstand verknüpft (Abbildung 1A)¹². Genauer gesagt wurde die C2-Domäne von Lactadherin (Bos taurus, UniProt: Q95114, Rückstände 270-427) in einen pGEX-4T3-Vektor geklont, der in Fusion mit Glutathion-S-Transferase (GST) in Escherichia coliexprimiert wird. Die_{C2-Lact-Sequenz} wurde dann mutiert, um zwei lösungsmittelzugängliche Cysteinreste (C270, C427) durch Alaninreste zu ersetzen und einen Cysteinrest in eine Region nahe der mutmaßlichen PS-Bindungsstelle (H352C-Mutation) einzuführen, die anschließend mit N,N’-Dimethyl-N-(iodoacetyl)-N’-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethylendiamin (IANBD)12 markiert werden kann. Zwischen dem GST-Protein und dem N-Terminus der C2-Domäne befindet sich eine Spaltstelle für Thrombin. Ein großer Vorteil ist, dass diese Domäne PS selektiv in einer Ca²⁺-unabhängigen Weise im Gegensatz zu anderen bekannten C2-Domänen oder Anhang in A5⁴²erkennt. NBD-PH_FAPP wird aus der PH-Domäne des humanen Vierphosphatadapterproteins 1 (FAPP1) abgeleitet, das überarbeitet wurde, um ein einzelnes lösungsmittelexponiertes Cystein zu enthalten, das mit einer NBD-Gruppe in der Nähe der PI(4)P-Bindungsstelle markiert werden kann (Abbildung 1A)⁴³. Die Nukleotidsequenz der PH-Domäne des humanen FAPP-Proteins (UniProt: Q9HB20, Segment [1-100]) wurde in einen pGEX-4T3-Vektor geklont, der zusammen mit einem GST-Tag exprimiert wird. Die_{PH-FAPP-Sequenz} wurde modifiziert, um einen einzigartigen Cysteinrest in die membranbindende Grenzfläche des Proteins⁴³einzufügen. Darüber hinaus wurde ein Linker mit neun Rückständen zwischen der Thrombinspaltungsstelle und dem N-Terminus der PH-Domäne eingeführt, um den Zugang zur Protease zu gewährleisten.

Um die PS-Extraktion aus Liposomen zu messen, wird NBD-C2_Lact mit Liposomen aus Phosphatidylcholin (PC) gemischt, die Spuren von PS enthalten. Aufgrund seiner Affinität zu PS bindet dieses Konstrukt an die Liposomen, und das NBD-Fluorophor erfährt eine Polaritätsänderung, wenn es mit der hydrophoben Umgebung der Membran in Kontakt kommt, was eine Blauverschiebung und eine Erhöhung der Fluoreszenz hervorruft. Wenn PS fast vollständig durch eine stöchiometrische Menge an LTP extrahiert wird, assoziiert sich die Sonde nicht mit Liposomen und das NBD-Signal ist niedriger (Abbildung 1B)³². Dieser Signalunterschied wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein LTP(z. B. Osh6p) PS extrahiert. Eine ähnliche Strategie wird mit NBD-PH_FAPP verwendet, um die PI(4)P-Extraktion zu messen (Abbildung 1B), wie zuvor^12,32beschrieben. Zwei FRET-basierte Assays wurden entwickelt, um (i) den PS-Transport von L_A- zu_{L-B-Liposomen,} die die ER-Membran bzw. das PM nachahmen, und (ii) den PI(4)P-Transport in umgekehrter Richtung zu messen. Diese Assays werden unter den gleichen Bedingungen(d. h. gleiche Puffer-, Temperatur- und Lipidkonzentration) durchgeführt, um den PS/PI(4)P-Austausch zumessen. Zur Messung des PS-Transports wird NBD-C2_Lact mit_{L-A-Liposomen} gemischt, die aus PC bestehen und mit 5 mol% PS und 2 mol% eines fluoreszierenden Rhodamin-markierten Phosphatidylethanolamins (Rhod-PE)- und L B-Liposomen mit 5 mol% PI(4)P dotiert.

Zum Zeitpunkt Null löscht FRET mit Rhod-PE die NBD-Fluoreszenz ab. Wird PS von L_A zu L_B Liposomen transportiert(z.B. bei Der Injektion von Osh6p), kommt es durch die Translokation von NBD-C2_Lact Molekülen von L_A zu L_B Liposomen zu einem schnellen Dequenching (Abbildung 1C). Angesichts der Menge an zugänglichem PS bleibt NBD-C2_Lact im Laufe des Experiments im Wesentlichen in einem membrangebundenen Zustand¹². Somit korreliert die Intensität des NBD-Signals direkt mit der Verteilung von NBD-C2_Lact zwischen L_A und L_B Liposomen und kann leicht normalisiert werden, um zu bestimmen, wie viel PS übertragen wird. Um den Transfer von PI(4)P in die entgegengesetzte Richtung zu messen, wird NBD-PH_FAPP mit L_A und L_B Liposomen gemischt; Da es nur an_{L-B-Liposomen} bindet, die PI(4)P enthalten, aber nicht an Rhod-PE, ist seine Fluoreszenz hoch. Wenn PI(4)P auf_{L-A-Liposomen} übertragen wird, transloziert es sich in diese Liposomen, und das Signal nimmt aufgrund von FRET mit Rhod-PE ab (Abbildung 1C). Das Signal wird normalisiert, um zu bestimmen, wie viel PI(4)P übertragen wird⁴³.