Визуализация живых клеток ROS во время развития нейронов

Передача сигналов активных форм кислорода (АФК) регулирует развитие и функционирование нервной^{системы1.} Важным клеточным источником АФК являются NADPH оксидазы (NOX), которые представляют собой трансмембранные белки, образующие супероксид и перекись водорода (H₂O₂₎^2. Ферменты NOX обнаруживаются по всей центральной нервной системе (ЦНС), а АФК, полученная из^NOX,способствует развитию нейронов^3,4,5,6. Было показано, что поддержание и дифференцировка нервных стволовых клеток, установление полярности нейронов, роста нейритов и синаптической пластичности требуют адекватных уровней АФК^7,8,9,10,11. С другой стороны, неконтролируемое производство АФК ТОКС способствуют нейродегенеративным расстройствам, включая болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и черепно-мозговую травму^12,13,14. Следовательно, производство физиологически значимого АФК имеет решающее значение для поддержания здоровых условий.

Разработка генетически закодированных биосенсоров значительно облегчила обнаружение клеточного АФК. Одним из важных преимуществ генетически закодированных биосенсоров является повышенное временное и пространственное разрешение сигнала АФК, поскольку эти датчики могут быть специально нацелены на различные места. Окислительно-чувствительный GFP (roGFP) является одним из типов таких биосенсоров ROS. Вариант roGFP2-Orp1 специфически обнаруживает H₂O₂ через свой домен Orp1, который представляет собой белок семейства глутатиона пероксиредоксинов из дрожжей^15,16. Окисление белка Orp1 переносится в roGFP2 для изменения его конформации(рисунок 1A). Зонд демонстрирует два пика возбуждения около 405 нм и 480 нм и один пик излучения при 515 нм. При окислении интенсивность флуоресценции вокруг пиков возбуждения изменяется: при увеличении возбуждения 405 нм снижается возбуждение на 480 нм. Таким образом, roGFP2-Orp1 является логометрическим биосенсором, а уровни_H2O₂-определяются соотношением интенсивностей флуоресценции, возбуждаемых на двух разных длинах волн(рисунок 1B). В целом, roGFP2-Orp1 является универсальным инструментом для визуализации АФК, который можно эффективно использовать in vivo.

Рисунок 1:Схематическое представление и спектры возбуждения roGFP2-Orp1. (A)Перенос окислителя происходит между Orp1 и roGFP2 в ответ на_H2O_2,что приводит к конформационным изменениям roGFP2. (B)Спектры возбуждения roGFP2-Orp1 демонстрируют два пика возбуждения при 405 нм и 480 нм и одинарный пик излучения при 515 нм. При окислении на_{H2O2 возбуждение}405 нм увеличивается, а возбуждение 480 нм уменьшается. Это приводит к ратиометрическому считываю для присутствия H₂O_2. Рисунок был изменен с Bilan and Belousov (2017)¹⁶ и Morgan et al. (2011)^25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Модельная система Danio rerio (рыбки данио) имеет ряд преимуществ для применения генетически закодированных биосенсоров. Оптическая прозрачность эмбрионов и личинок позволяет проводить неинвазивную визуализацию in vivo. Разрабатываются новые инструменты визуализации для достижения более высокого разрешения и более глубокого проникновения¹⁷. Кроме того, существуют установленные инструменты для генетических манипуляций (эктопическая экспрессия мРНК, трансгенез Tol2 и др.) и редактирования генома (TALENs, CRISPR/Cas9 и др.), что способствует генерации трансгенных животных^18. Поскольку эмбрионы рыбок данио развиваются вне матери, эта система дополнительно облегчает доступ и манипулирование эмбрионами. Например, инъекции на одноклеточной стадии и медикаментозное лечение могут быть легко сделаны.

Здесь мы использовали рыбок данио для временной экспрессии_H2O_{2-специфического}биосенсора roGFP2-Orp1 путем инъекции транскрибированной in vitro мРНК. Эти эмбрионы могут быть использованы как для визуализации культивированных нейронов in vitro, так и для визуализации in vivo (рисунок 2). Мы описываем протокол для рассечения и покрытия ганглиозных клеток сетчатки (RGC) из эмбрионов рыбок данио с последующей оценкой уровней_H2O₂в культивированных нейронах. Затем мы представляем метод визуализации in vivo roGFP2-Orp1-экспрессирующих эмбрионов и личинок с использованием конфокальной микроскопии. Такой подход позволяет не только определить физиологические уровни_H2O_2,но и потенциальные изменения, происходящие на разных стадиях развития или в различных условиях. В целом, эта система обеспечивает надежный метод обнаружения_H2O₂ в живых клетках и животных для изучения роли_H2O₂ в развитии, здоровье и болезни.

Рисунок 2. Схема экспериментального подхода. Вкратце, после сбора эмбрионов, мРНК roGFP2-Orp1 вводят в желток эмбрионов одноклеточной стадии данио. Развивающиеся эмбрионы могут быть использованы как для(A) in vitro, так и(B) in vivo визуализации. (A) GFP-положительные эмбрионы используются для рассечения сетчатки для сбора RGC при 34 л.с. Диссоциированные RGC покрываются на обшивки с PDL/ламининым покрытием в средах ZFCM (+). Визуализация конуса роста может проводиться по мере того, как RGC расширяют свои аксоны после 6-24 ч покрытия. Клетки могут подвергаться различным методам лечения для измерения потенциальных изменений в уровнях_H2O_2. Здесь мы измерили_H2O₂-уровни в ростовых конусах RGC (красный). (B)GFP-положительные эмбрионы используются для визуализации in vivo. В желаемом возрасте эмбрионы могут быть обезболиваться и устанавливаться на стеклянную посуду со стеклянным дном 35 мм для конфокальной визуализации. Здесь эмбрионы устанавливаются вентрально для визуализации сетчатки. Схема показывает развитие сетчатки у рыбок данио. RGC образуют ганглионный клеточный слой (GCL), который является самым внутренним слоем в сетчатке. Аксоны RGC развиваются в зрительный нерв, пересекая среднюю линию, образуя зрительный хиазм. Затем аксоны RGC растут дорсально, чтобы сделать синапсы в зрительном тектуме в среднем мозге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.