Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

La segnalazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS) regola lo sviluppo e il funzionamento del sistema^{nervoso 1}. Un’importante fonte cellulare di ROS sono le ossidasi NADPH (NOX), che sono proteine transmembrana che generano superossido e perossido di idrogeno (H₂O₂)². Gli enzimi NOX si trovano in tutto il sistema nervoso centrale (SNC) e il ROS derivato dal NOX contribuisce allo sviluppo^{neuronale 3,4,5,6}. Il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali neurali, stabilendo polarità neuronale, crescita della neurite e plasticità sinaptica hanno dimostrato di richiedere livelli adeguati di ROS^7,8,9,10,11. D’altra parte, la produzione incontrollata di ROS da parte dei NOX contribuisce a disturbi neurodegenerativi tra cui il morbo di Alzheimer, la sclerosi multipla e la lesione cerebrale^{traumatica 12,13,14}. Pertanto, la produzione di ROS fisiologicamente rilevante è fondamentale per mantenere condizioni sane.

Lo sviluppo di biosensori geneticamente codificati ha facilitato notevolmente il rilevamento del ROS cellulare. Un importante vantaggio dei biosensori geneticamente codificati è l’aumento della risoluzione temporale e spaziale del segnale ROS, poiché questi sensori possono essere specificamente mirati a posizioni distinte. La GFP sensibile ai redox (roGFP) è un tipo di biosensori ROS di questo tipo. La variante roGFP2-Orp1 rileva specificamente H₂O_{2 attraverso} il suo dominio Orp1, che è una proteina della famiglia glutatione perossiredossina dal^{lievito 15,16}. L’ossidazione della proteina Orp1 viene trasferita al roGFP2 per alterarne la conformazione (Figura 1A). La sonda presenta due picchi di eccitazione vicino a 405 nm e 480 nm e un singolo picco di emissione a 515 nm. All’ossidazione, l’intensità di fluorescenza intorno ai picchi di eccitazione cambia: mentre aumenta l’eccitazione di 405 nm, diminuisce l’eccitazione di 480 nm. Pertanto, roGFP2-Orp1 è un biosensore ratiometrico, e i livelli H₂O_{2 sono}rilevati dal rapporto di intensità di fluorescenza eccitate a due diverse lunghezze d’onda (Figura 1B). Nel complesso, roGFP2-Orp1 è uno strumento versatile per l’imaging ROS che può essere utilizzato in modo efficiente in vivo.

Figura 1: Rappresentazione schematica e spettri di eccitazione del trasferimento ossidante roGFP2-Orp1. (A) avviene tra Orp1 e roGFP2 in risposta a H₂O_2,portando a cambiamenti conformazionali nel roGFP2. (B) Gli spettri di eccitazione del roGFP2-Orp1 presentano due picchi di eccitazione a 405 nm e 480 nm e un picco di emissione singola a 515 nm. All’ossidazione di H₂O₂, l’eccitazione di 405 nm aumenta mentre l’eccitazione di 480 nm diminuisce. Ciò si traduce in una lettura ratiometrica per la presenza di H₂O_2. La cifra è stata modificata da Bilan e Belousov (2017)¹⁶ e Morgan et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il sistema di modelli Danio rerio (zebrafish) presenta diversi vantaggi per l’applicazione di biosensori geneticamente codificati. La trasparenza ottica degli embrioni e delle larve consente l’imaging in vivo non invasivo. Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti di imaging per ottenere una risoluzione più elevata e una penetrazione^{più profonda 17}. Inoltre, esistono strumenti consolidati per la manipolazione genetica (espressione ectopica di mRNA, transgenesi Tol2, ecc.) e l’editing del genoma (TALEN, CRISPR / Cas9, ecc.), che promuove la generazione di animali transgenici¹⁸. Man mano che gli embrioni di zebrafish si sviluppano al di fuori della madre, questo sistema consente ulteriormente un accesso e una manipolazione più facili degli embrioni. Ad esempio, le iniezioni a uno stadio e i trattamenti farmacologici possono essere facilmente eseguiti.

Qui, abbiamo usato il pesce zebra per esprimere transitoriamente il biosensore specifico H₂O₂roGFP2-Orp1 iniettando mRNA trascritto in vitro. Questi embrioni possono essere utilizzati sia per l’imaging in vitro di neuroni coltivati che per l’imaging in vivo ( Figura2). Descriviamo un protocollo per la sezionatura e la placcatura delle cellule gangliari retiniche (GRGC) da embrioni di zebrafish seguito dalla valutazione dei livelli di H₂O₂nei neuroni coltivati. Quindi, presentiamo un metodo per l’imaging in vivo di embrioni e larve che esprimono roGFP2-Orp1 usando la microscopia confocale. Questo approccio non solo consente di determinare i livelli fisiologici di H₂O_2,ma anche i potenziali cambiamenti che si verificano in diversi stadi o condizioni di sviluppo. Nel complesso, questo sistema fornisce un metodo affidabile per rilevare H₂O₂ in cellule vive e animali per studiare il ruolo di H₂O₂ nello sviluppo, nella salute e nelle malattie.

Figura 2. Schema dell’approccio sperimentale. In breve, dopo la raccolta dell’embrione, l’mRNA roGFP2-Orp1 viene iniettato nel tuorlo di embrioni zebrafish a una cellula. Gli embrioni in via di sviluppo possono essere utilizzati sia perl’imaging in vitro ( A ) che perl’imaging in vivo ( B ). (A) Gli embrioni positivi alla GFP vengono utilizzati per sezionare retine per la raccolta RGC a 34 hpf. Le RGC dissociate sono placcate su coverlips rivestite in PDL/laminina in supporti ZFCM (+). L’imaging del cono di crescita può essere condotto mentre le RGC estendono i loro assoni dopo 6-24 ore di placcatura. Le cellule possono essere sottoposte a diversi trattamenti per misurare i potenziali cambiamenti nei livelli H₂O_2. Qui, abbiamo misurato i_{livelli H 2}O₂nei coni di crescita delle GRGC (rosso). (B) Gli embrioni positivi alla GFP sono utilizzati per l’imaging in vivo. All’età desiderata, gli embrioni possono essere anestetizzati e montati su piatti di fondo in vetro da 35 mm per l’imaging confocale. Qui, gli embrioni sono montati ventralmente per l’imaging retinale. Schema mostra lo sviluppo retinale nel pesce zebra. Le GRGC formano lo strato cellulare ganglionale (GCL), che è lo strato più interno della retina. Gli assoni RGC si sviluppano nel nervo ottico per attraversare la linea mediana, formando chiasmo ottico. Quindi, gli assoni RGC crescono dorsalmente per fare sinapsi nel tectum ottico nel midbrain. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.