ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Die Signalisierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) reguliert die Entwicklung und Funktion des Nervensystems¹. Eine wichtige zelluläre ROS-Quelle sind NADPH-Oxidasen (NOX), bei denen es sich um Transmembranproteine handelt, die Superoxid und Wasserstoffperoxid_(H2O2)²erzeugen. NOX-Enzyme finden sich im gesamten zentralen Nervensystem (ZNS), und NOX-abgeleitetes ROS trägt zur neuronalen Entwicklung bei^3,4,5,6. Es wurde gezeigt, dass die Erhaltung und Differenzierung neuronaler Stammzellen, die Etablierung neuronaler Polarität, Neuritenauswuchs und synaptischer Plastizität ausreichende Mengen an ROS^7,8,9,10,11erfordern . Auf der anderen Seite trägt die unkontrollierte Produktion von ROS durch NOXen zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Multipler Sklerose und traumatischen Hirnverletzungen bei^12,13,14. Daher ist die Produktion von physiologisch relevantem ROS entscheidend für die Aufrechterhaltung gesunder Bedingungen.

Die Entwicklung genetisch kodierter Biosensoren erleichterte den Nachweis von zellulärem ROS erheblich. Ein wichtiger Vorteil genetisch kodierter Biosensoren ist die erhöhte zeitliche und räumliche Auflösung des ROS-Signals, da diese Sensoren gezielt auf unterschiedliche Orte ausgerichtet werden können. Redox-sensitive GFP (roGFP) ist eine Art solcher ROS-Biosensoren. Die roGFP2-Orp1-Variante detektiert spezifisch_H2O2durch seine Orp1-Domäne, die ein Glutathion-Peroxiredoxin-Familienprotein aus Hefe^15,16ist. Die Oxidation des Orp1-Proteins wird auf roGFP2 übertragen, um seine Konformation zu verändern (Abbildung 1A). Die Sonde weist zwei Anregungsspitzen nahe 405 nm und 480 nm sowie einen einzigen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei der Oxidation ändert sich die Fluoreszenzintensität um Anregungsspitzen: Während die Anregung um 405 nm zunimmt, nimmt die Anregung um 480 nm ab. Somit ist roGFP2-Orp1 ein ratiometrischer Biosensor, und_H2O2-Spiegelwerden durch das Verhältnis der Fluoreszenzdicken detektiert, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden ( Abbildung1B). Insgesamt ist roGFP2-Orp1 ein vielseitiges Werkzeug für die ROS-Bildgebung, das in vivoeffizient eingesetzt werden kann.

Abbildung 1: Schematische Darstellung und Anregungsspektren von roGFP2-Orp1. (A) Oxidationsmitteltransfer findet zwischen Orp1 und roGFP2 als Reaktion auf_H2O2statt, was zu Konformationsänderungen in roGFP2 führt. (B) Die Anregungsspektren des roGFP2-Orp1 weisen zwei Anregungspeaks bei 405 nm und 480 nm und einen einzelnen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei Oxidation durch_H2O2nimmt die 405 nm Anregung zu, während die 480 nm Anregung abnimmt. Daraus ergibt sich eine ratiometrische Auslesung für H2O2-Anwesenheit. Die Figur wurde von Bilan und Belousov (2017)¹⁶ und Morgan et al. (2011)²⁵modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das Modellsystem Danio rerio (Zebrafisch) hat mehrere Vorteile für die Anwendung genetisch kodierter Biosensoren. Die optische Transparenz der Embryonen und Larven ermöglicht eine nicht-invasive In-vivo-Bildgebung. Neue Bildgebungswerkzeuge werden entwickelt, um eine höhere Auflösung und eine tiefere Durchdringung zu erreichen¹⁷. Darüber hinaus gibt es etablierte Werkzeuge zur genetischen Manipulation (ektopische mRNA-Expression, Tol2-Transgenese usw.) und Genom-Editing (TALENs, CRISPR/Cas9 usw.), die die Erzeugung transgener Tiere fördern¹⁸. Da sich die Zebrafischembryonen außerhalb der Mutter entwickeln, ermöglicht dieses System einen leichteren Zugang und eine einfachere Manipulation der Embryonen. Zum Beispiel können Injektionen und medikamentöse Behandlungen im Einzelzellstadium leicht durchgeführt werden.

Hier verwendeten wir Zebrafische, um den_{H2O2-spezifischen}Biosensor roGFP2-Orp1 transient zu exprimieren, indem wir in vitro-transkribierte mRNA injizierten. Diese Embryonen können sowohl für die In-vitro-Bildgebung von kultivierten Neuronen als auch für die In-vivo-Bildgebung verwendet werden (Abbildung 2). Wir beschreiben ein Protokoll zur Sezierung und Beschichtung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) aus Zebrafischembryonen, gefolgt von der Beurteilung der_H2O2-Spiegelin kultivierten Neuronen. Anschließend stellen wir eine Methode zur In-vivo-Bildgebung von roGFP2-Orp1-exprimierenden Embryonen und Larven mittels konfokaler Mikroskopie vor. Dieser Ansatz ermöglicht nicht nur dieBestimmung physiologischer_{H2O2-Spiegel,}sondern auch potenzielle Veränderungen, die in verschiedenen Entwicklungsstadien oder -bedingungen auftreten. Insgesamt bietet dieses System eine zuverlässige Methode zum Nachweis von_H2O2in_lebenden Zellen und Tieren, um die Rolle von_H2O2in Entwicklung, Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.

Abbildung 2. Überblick über den experimentellen Ansatz. Kurz gesagt, nach der Embryoentnahme wird roGFP2-Orp1 mRNA in das Eigelb von einzelligen Zebrafischembryonen injiziert. Sich entwickelnde Embryonen können sowohl für (A) in vitro als auch (B) in vivo Bildgebung verwendet werden. (A) GFP-positive Embryonen werden verwendet, um Netzhäute für die RGC-Sammlung bei 34 HPF zu sezieren. Dissoziierte RGCs werden auf PDL/Laminin-beschichteten Deckschichten in ZFCM(+)-Medien plattiert. Wachstumskegelbildgebung kann durchgeführt werden, wenn RGCs ihre Axone nach 6-24 Stunden Beschichtung erweitern. Zellen können verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, um die möglichen Veränderungen der_H2O2-Spiegelzu messen. Hier haben wir_H2O2-Spiegelin den Wachstumskegeln von RGCs (rot) gemessen. (B) GFP-positive Embryonen werden für die In-vivo-Bildgebung verwendet. Im gewünschten Alter können Embryonen betäubt und auf 35 mm Glasbodenschalen für die konfokale Bildgebung montiert werden. Hier werden Embryonen ventral für die netzhautale Bildgebung montiert. Schematisch zeigt die Netzhautentwicklung bei Zebrafischen. RGCs bilden die Ganglienzellschicht (GCL), die die innerste Schicht in der Netzhaut ist. RGC-Axone entwickeln sich zu Sehnerven, um die Mittellinie zu überqueren und optisches Chiasmus zu bilden. Dann wachsen RGC-Axone dorsal, um Synapsen im optischen Tectum im Mittelhirn zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.