Canlı Görüntüleme Kullanarak Oksidatif Hasarın Drosophila Yumurta Odaları Üzerindeki Etkilerini Görselleştirme
Summary
Bu protokolün amacı, Drosophila yumurtalıklarındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki oksidatif hasarın etkilerini görselleştirmek için canlı görüntüleme kullanmaktır.
Abstract
Drosophila melanogaster yumurtalıklarının canlı görüntülenmesi, ribonikleoprotein parçacık hareketi, mRNA lokalizasyonu, organel hareketi ve sitoskeletal dinamikler de dahil olmak üzere gelişim sırasında çeşitli temel hücresel süreçlerin anlaşılmasında etkili olmuştur. Canlı görüntüleme için geliştirilmiş çeşitli yöntemler vardır. Her yöntemin medyaya veya halokarbon yağına yerleştirilen bireysel ovariolelerin diseksiyonu içermesi nedeniyle, hipoksi ve / veya fiziksel manipülasyona bağlı hücresel hasar kaçınılmaz olarak zamanla ortaya çıkacaktır. Hipoksinin aşağı yönlü etkilerinden biri hücrelerdeki oksidatif hasarı arttırmaktır. Bu protokolün amacı, kontrollü hücresel hasarın indüksiyonu sonrasında Drosophila yumurtalıklarındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki oksidatif hasarın etkilerini görselleştirmek için canlı görüntüleme kullanmaktır. Burada, hücresel oksidatif hasara neden olmak için hidrojen peroksit kullanıyoruz ve bu tür hasarın iki hücre altı yapı, mitokondri ve Clu mutluluk parçacıkları üzerindeki etkilerinden örnekler veriyoruz. Ancak, bu yöntem herhangi bir alt hücre yapısı için geçerlidir. Sınırlamalar, hidrojen peroksitin sadece sulu ortamlara eklenebilmesi ve halokarbon yağı kullanan görüntüleme için çalışmamasıdır. Avantajları, hidrojen peroksitin kolayca kullanılabilir ve ucuz olması, hızlı hareket etmesi, konsantrasyonlarının modüle edilebilmesi ve oksidatif hasarın, manipülasyona bağlı genel doku hasarının yanı sıra hipoksinin neden olduğu hasarın iyi bir yaklaşık olmasıdır.
Introduction
Doku ex vivo’nun deneysel kültürü ve manipülasyonu sırasında ısı şoku, oksidatif stres, ozmotik stres, beslenme stresi ve toksisite koşulları dahil olmak üzere birden fazla farklı hücresel stresör ortaya çıkabilir. Canlı görüntüleme, deneysel tedavi ve manipülasyondan sonra ex vivo dokulardaki gerçek zamanlı değişiklikleri görselleştirmek için kullanılan güçlü bir araçtır. İnce doku diseksiyonları ve manipülasyon pratik alır ve diseksiyondan görüntülemeye kadar geçen süre deneyime bağlı olarak değişebilir. Bu yöntemi geliştirmenin gerekçesi, canlı görüntüleme için doku hazırlamanın diseksiyon ve görüntüleme hazırlığı sırasında hücresel strese neden olabileceği endişesine dayanmaktadır. Bu, hücresel metabolizmadaki değişikliklere ve mitokondriyal fonksiyon gibi mevcut oksijen seviyelerine duyarlı süreçler için özellikle sorunlu olabilir. Paralel vahşi tip bir örneğe sahip olmak önemli bir kontrol olmakla birlikte, hücre altı yapılarda gözlenen değişikliklerin bir kısmının veya tamamının diseksiyondan kaynaklanan hasar veya hücre stresinden kaynaklanabileceği ve normal fizyolojiyi veya çalışılan tedaviyi veya mutasyonu yansıtmadığı olasılığı hala vardır.
Bu potansiyel sorunu gidermek için, hücresel oksidatif hasara neden olmak için canlı görüntüleme sırasında hidrojen peroksit ilavesi kullanıyoruz1. Bu yöntemin amacı, hücre altı yapılar üzerindeki etkiyi izlemek için dokulara zarar vermektir. Bu protokol iki amaç için yararlıdır: 1) ilgi yapısının hücre altı lokalizasyonundaki değişikliklerin deneyimsiz diseksiyonun neden olduğu strese bağlı olup olmadığını belirlemek ve 2) araştırmacı kontrollü stresin ilgi yapısı üzerindeki etkisini izlemek için açıklanan diseksiyon tekniklerinden emin olduğunda. Burada artan oksidatif hasarın iki hücre altı yapıda, mitokondri ve Clu saadet parçacıklarında nasıl değişikliklere neden olduğuna dair iki örnek gösteriyoruz. Bunu yapmak için canlı görüntüleme çalışmaları için yaygın bir model olan Drosophila yumurtalığını kullanıyoruz. İlk örnek mitokondriyal lokalizasyonu inceler. Deneyimlerimize göre, kadın mikrop hücrelerinde normal mitokondriyal lokalizasyon pertürbasyonlara karşı oldukça hassastır ve hücresel stresin habercisi olarak işlev görebilebilir. Drosophila kadın mikrop hücrelerindeki mitokondri normalde sitoplazma boyunca eşit olarak dağılır2. Hidrojen peroksit ilavesi, organellerin çeşitli mutasyonlara benzer şekilde hızla yanlış ölçeklenmesine ve kümelenmesine neden olur3,4,5. İkinci örnek Clueless (Clu) tarafından oluşturulan saadet parçacıklarıdır. Clu sitoplazma boyunca yaygın olan bir ribonucleoproteindir; bununla birlikte, optimal hücresel koşullar altında mitokondri ile ilişkili parçacıklar da oluşturur5. Clu parçacıklarının varlığı sağlıklı hücresel koşullara bağlı olduğundan, onları “mutluluk” parçacıkları3,5,6. Hidrojen peroksit ilavesi, bu parçacıkların hızla dağılmasına ve sitoplazmda homojen hale gelmesine neden olur5. Çalışmalarımız boyunca, bu hücre altı yapıların her ikisinin lokalizasyonunda değişiklikler gözlemledik, ancak ancak canlı görüntüleme çalışmaları yaptıktan sonra hücresel stres ve oksidatif hasarın mitokondri ve saadet parçacıklarının lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki etkisini tam olarak takdir edebiliriz.
Bu protokolün zaten belirlenmiş veya alternatif yöntemlere ek olarak yardımcı programı çeşitli faktörlere bağlıdır. İlk olarak, görüntüleme protokolü ilaç eklemeye uygun olmalıdır. Numune bir kapak kılıfı altına ve halokarbon yağına monte edilmişse, bu yöntem mümkün olmayacaktır7. H2O2 ilavesi oksidatif hasarda hızlı bir artışa neden olur, bu nedenle bu zaman ölçeği uygun olmayabilir. Oksidatif hasar hipoksi için bir proxy olarak kabul edilebilir; ancak, belirli hücre altı bileşenler için hasar için uygun bir kontrol olarak çalışmak için çok sert veya çok genelleştirilmiş olabilir. Son olarak, bir gelişim sürecini izleyenler gibi saatler süren görüntüleme deneyleri için, H2O2 ilavesi çok güçlü olabilir (örneğin8). Bir konsantrasyon eğrisini test etmek bu sınırlamayı aşabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, herhangi bir canlı görüntüleme deneyi için yumurtalık diseksiyonu ve doku inkübasyonu nedeniyle eserler için bir kontrol olarak yararlı bir ek olabilir. Kritik adımlar, diğer canlı görüntüleme protokolleri için bulunanlara benzer. Tüm Drosophila yumurtalıklarının nasıl inceldiğini öğrenmek pratik gerektirir; ancak, bu beceri genellikle uygun diseksiyon araçları ile oldukça hızlı bir şekilde öğrenilebilir. Ustalaşması daha zor yumurtalıkları saran kası çıkarmaktır ve her ovariole13. Bu, kas kasılmalarının görüntü alımını engellememesi için yapılmalıdır. Bunu yapmak için keskinleştirilmiş tungsten iğneleri kullanmak başarılı olmazsa, ovariole’nin ucundaki germarium,ps ve kas kılımından çekilen yumurtalık ile kavranabilir. Ancak en erken gelişim evreleri hasar görebildikleri için incelenecekse bu teknik sorunludur. Bir diğer önemli adım, H 2O2eklerken çanağın altında dinlenmiş ovarioles yerinden çıkmamaktır. Ek bir önemli husus tüm canlı görüntüleme tarafından paylaşılmıştır: araştırmacı, tedaviden önce ilgi yapısının floresan olarak iyi etiketlenmiş olduğundan emin olmalıdır. Burada kullanılan yemekler (Malzeme Masası) canlı görüntüleme için yaygın olarak kullanılır; bununla birlikte, altta cam bir kapakçık veya hatta büyük bir cam kapaklı herhangi bir çanak veya slayt, medya buharlaşmasını önlemek için ortam damlası kapsanabildiği sürece çalışmalıdır. Belirli bir mikroskop kullanırken, söz konusu hücre altı yapıyı ve yeterli çözünürlük ve görüntü yakalama hızına sahip ekli bir kamerayı görmek için yeterli büyütme hedefine sahip herhangi bir ters mikroskop çalışmalıdır.
Laboratuvarımız öncelikle mitokondriyal fonksiyonla ilgilenirken, bu yöntem çekirdek, sitoskeleton veya endoplazmik retikulum gibi herhangi bir hücre altı yapının veya organellerin dinamiklerini ve lokalizasyonunu incelemek yararlı olabilir. Ancak, bu yöntemin sınırlamaları vardır. Hidrojen peroksit eklemek için, doku sulu bir ortamda olmalıdır. Canlı görüntüleme için alternatif bir yöntem, bir model organizmada GFP’nin dinamik hareketinin ilk örneği de dahil olmak üzere Drosophila ovarioles’teki birçok önemli süreci tanımlamada etkili olan halokarbon yağı kullanmaktır7,14. Ek olarak, medyaya hidrojen peroksit eklemek, özellikle gelişimi inceleyen daha uzun deneyler için, ilgi çekici hücresel süreç için bilgilendirici olamayacak kadar genel bir dokuya hakaret olabilecek geniş yayılmış oksidatif hasara neden olur. Bu hızlı, kapsamlı ve muhtemelen geri dönüşü olmayan oksidatif hasar nedeniyle hücrenin uzun süreler boyunca görselleştirilmesini gerektiren deneyler yapmak mümkün olmasa da, tarif ettiğimiz akut hidrojen peroksit tedavisinin, görüntüleme süresi içinde çoğu aşamada aynı etkileri görebildiğimiz için oogenezisin çoğu aşaması için geçerli olduğunu gördük. Protokolün düşük maliyeti ve kolaylığı göz önüne alındığında, hasar için yararlı bir kontrol olabilir ve fiksasyon ve antikor etiketlemesinden önce bir tedavi olarak da kullanılabilir.
Elimizde H2O2 tedavisi, çeşitli Drosophila mutantlarında gördüğümüz mitokondriyal yanlış hesaplama ve Clu saadeti parçacık dağılımındaki değişiklikleri taklit eder. Ayrıca laboratuvarda diseksiyon tekniklerini öğrenen yeni araştırmacılar için gördüğümüz sonuçları taklit eder. Bu nedenle, bu yöntem, örnek hazırlama ve genel hücresel stresin mitokondriyal yanlış hesaplamada beklenmedik ve daha önce açıklanamayan değişikliklere ve mutluluk parçacıklarının varlığına yol açabileceğini açıkça ortaya koydu. Bu tekniği ileriye taşıyarak, hidrojen peroksit konsantrasyonları daha yüksek veya daha düşük bir konsantrasyon kullanılarak modüle edilebilir. Daha düşük bir konsantrasyon kullanılarak hücresel bir etki görülürse, ortamı Complete Schneider’s ile değiştirerek stres fenotipinin tersine çevrilebilir olması mümkündür. Karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP), arsenit veya basit ısı şoku gibi farklı hücre stresörleri, diğer hücre altı yapılar için genel hücresel stres için yararlı olabilir. Ex vivo dokuların canlı görüntülenmesi farklı ortamlarda manuel manipülasyon ve inkübasyon gerektirdiğinden, bu kontrol herhangi bir gözlemin normal fizyolojiye mümkün olduğunca yakın olmasını sağlamak için yararlı bir ek olmalıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Görüntüleme desteği için Dr. Jeremy Smyth’e ve illüstrasyonlar, prodüksiyon ve videografi için Ann C. Shenk’e teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R01GM127938 ila R.T.C.) tarafından desteklendi.
Materials
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
