Visualización de los efectos del daño oxidativo en las cámaras de huevos de Drosophila usando imágenes en vivo

1. Preparación de medios de disección e imágenes NOTA: El medio más adecuado para este experimento de imágenes en vivo contiene los medios Drosophila de Schneider que contienen un 15% de suero bovino fetal inactivado por calor, 0,6 veces Pen-Strep y 200 μg/ml de insulina bovina, en lo sucesivo denominados medios de comunicación de Complete Schneider. Realice la preparación de los medios bajo condiciones estériles para asegurarse de que no se contamine. Los medios de comunicación fueron desarrollados para apoyar a Drosophila ovarioles durante largos períodos de tiempo9. Agregue un 15% de suero bovino fetal inactivado por calor, 0,6 veces pen-strep y 200 μg/ml de insulina bovina a los medios de comunicación de Schneider. Mezcle bien el contenido y guárdelo a 4 °C durante la noche.NOTA: La insulina no se disuelve por completo en los medios de comunicación de Complete Schneider, y notará un precipitado asentarse en la parte inferior del tubo. Haga alícuotas de los medios de comunicación, asegurándose de dejar el precipitado, ya que interferirá con las imágenes.NOTA: Esta solución se puede utilizar en el plazo de un mes si se almacena en alícuotas a 4 °C. 2. Colección de Drosophila para la disección NOTA: Los procedimientos detallados de recopilación y disección de Drosophila también se pueden encontrar en Weil et al.10 y Parker et al.11. Para obtener imágenes óptimas de células germinales femeninas, primero prepare un vial que contenga alimentos estándar para moscas de la harina de maíz y un poco de pasta de levadura húmeda que es la consistencia de la mantequilla de maní. Esto garantiza que las moscas hembra estén bien alimentadas y produzcan todas las etapas de desarrollo folículo para la toma de imágenes. Para moscas óptimamente sanas, recoger hembras de 0-1 día de edad y transferir con machos en un vial de alimento mosca que contiene pasta de levadura húmeda.NOTA: Asegúrese de que las moscas durmientes no se pongan en contacto con la pasta de levadura, ya que pueden pegarse a ella. Alimente las moscas de 3 a 7 días, cambiando el vial y la pasta de levadura diariamente.NOTA: Asegúrese de que la pasta de levadura entre en contacto con el alimento para mosca para que no se seque. 3. Disección del ovario Drosophila NOTA: Es importante preparar las soluciones multimedia frescas porque el peróxido de hidrógeno es susceptible a la oxidación y TMRE se degrada con el tiempo. Justo antes de la disección, en los medios de Complete Schneider, preparar una nueva alícuota de solución de 2 μM H2O2, una alícuota fresca de 46 nM tetrametilrhodamina, éster etílico (TMRE) y una nueva alícuota de una solución TMRE de 46 nM que contiene 2 μM H2O2. Para la disección del ovario, utilice dos pares de fórceps finos y un par de agujas de tungsteno electrolíticamente afiladas12. Para diseccionar los ovarios, llene 2-3 pozos de un plato de disección de fondo de vidrio (vaso de reloj) con Complete Schneider’s que se ha calentado a temperatura ambiente. Anestesiar el vial de moscas engordadas con dióxido de carbono y segregar el número deseado de moscas hembra para ser diseccionadas. Coloque una sola mosca en los medios usando fórceps. Bajo un microscopio diseccionador, sujete suavemente la mosca por el tórax usando un par de fórceps finos. Con el otro par de fórceps, agarre la parte posterior y tire suavemente para extirpar los ovarios.NOTA: si los ovarios no salen suavemente usando este método, también se puede extirpar todo el abdomen de la mosca, y los ovarios se pueden exprimir suavemente de cualquiera de los extremos del abdomen usando fórceps. Retire cualquier cutícula o tejido extraño y, a continuación, transfiera los ovarios a un nuevo pozo que contenga medios frescos. Los ovarios todavía deben moverse de la vatina muscular circundante. 4. Preparación de los ovarioles para la toma de imágenes Usando agujas de tungsteno afilados, burlarse suavemente de los ovarioles, teniendo cuidado de eliminar la sheath muscular circundante(Figura 1). Burlarse suavemente de cualquier vatina muscular y fibras nerviosas unidas a los ovarioles aislados(Figura 2).NOTA: Si no se elimina la vatina muscular, el ovariole se agitará y se moverá, causando problemas con la adquisición de imágenes(Video 1). Si las estructuras subcelulares de interés están etiquetadas endógenamente, proceda al paso 4.4. Si las estructuras de interés serán etiquetadas con un tinte fluorescente, proceda a la Sección 5. Una vez que los ovarioles hayan sido diseccionados limpiamente, usando un micropipette, transfiéralos en una caída de 100 μL de los medios de imágenes de Complete Schneider en la depresión de vidrio de un plato inferior de vidrio. Los ovarioles individuales se hundirán en la parte inferior de la gota. Vaya a la Sección 6 para obtener imágenes.NOTA: Para las mitocondrias por imágenes y las partículas de Clu bliss, no deben transcurrir más de cinco o diez minutos desde el inicio de la disección hasta la toma de imágenes. 5. Mitocondrias de tinción con TMRE NOTA: Se pueden encontrar procedimientos detallados adicionales sobre la tinción viva de mitocondrias con tintes fluorescentes en Parker et al. 2017. Después del paso 4.3, transfiera los ovarioles aislados en una caída de 100 μL de soporte TMRE de 46 nM en la depresión de vidrio de un plato inferior de vidrio. Los ovarioles individuales se hundirán en la parte inferior de la gota. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Coloque la tapa en el plato con fondo de vidrio y coloque el plato en una caja cubierta durante el experimento para protegerlo de la luz.NOTA: Después de la incubación, las muestras se pueden tomar imágenes directamente sin lavados. Repita los pasos 5.1-5.2 para preparar al menos dos platos de ovarioles etiquetados con TMRE, uno para servir como grupo experimental y otro para servir como control. 6. Adquisición de imágenes en vivo Una vez montados los ovarioles, coloque uno de los platos inferiores de vidrio en el microscopio y configure los parámetros de imagen según sea necesario. Las longitudes de onda óptimas de excitación/emisión para el TMRE utilizado aquí son de 549 nm/574 nm. Después de localizar el campo de visión deseado, adquiera imágenes fijas o videos breves de uno o más ovarioles como desee como un registro de condiciones previas al tratamiento. 7. Adición de peróxido de hidrógeno durante la toma de imágenes Pausa las imágenes en vivo, retira la tapa del plato inferior de vidrio y añade cuidadosamente 100 μL de solución de 2 μM H2O2 al plato usando un micropipette si se toma imágenes de estructuras etiquetadas endógenamente. Si se toma imágenes de mitocondrias, agregue cuidadosamente 100 μL de 46 nM TMRE con 2 μM H2O2 solución al plato utilizando un micropipette (Video 2). Evite romper la superficie de la gota de soporte existente o añadir la solución demasiado rápido para no desplazar los ovarioles que descansan en la parte inferior del plato(Video 2). Reemplace la tapa del plato (cubierta del plato), reubique y vuelva a enfocar el campo de visión deseado si es necesario, y reanude las imágenes(Vídeo 3, Video 4, Figura 3, Figura 4). Cuídate de reanudar las imágenes lo más rápido posible después de la adición de H2O2, ya que el tratamiento experimental es sensible al tiempo(Video 5). Adquirir imágenes fijas o videos breves de uno o más ovarioles como se desee. Esto servirá como un registro de las condiciones posteriores al tratamiento. Para el control, coloque el segundo plato inferior de vidrio en el microscopio y repita la Sección 6. Repita el paso 7.1, esta vez añadiendo 100 μL de soporte solo TMRE al plato. Si se toma imágenes de estructuras etiquetadas endógenamente, añada 100 μL de la solución de solo medios de Complete Schneider. Repita los pasos 7.2 y 7.3 para adquirir datos para el grupo de control.NOTA: Para las mitocondrias por imágenes y las partículas Clu bliss, no deben transcurrir más de tres o cinco minutos desde la adición de peróxido de hidrógeno hasta la toma de imágenes.