Визуализация воздействия окислительного повреждения на drosophila яичные камеры с помощью Live Imaging
Summary
Целью данного протокола является использование живой визуализации для визуализации влияния окислительного повреждения на локализацию и динамику субклеточных структур в яичниках дрозофилы.
Abstract
Live изображения яичников Drosophila меланогастер сыграл важную роль в понимании различных основных клеточных процессов во время развития, в том числе рибонуклеопротеин движения частиц, локализации мРНК, органелл движения, и цитоскелетной динамики. Существует несколько методов живой визуализации, которые были разработаны. В связи с тем, что каждый метод включает в себя вскрытие отдельных яичников, помещенных в средства массовой информации или галоуглеродное масло, повреждение клеток из-за гипоксии и/или физических манипуляций неизбежно произойдет с течением времени. Один вниз по течению эффект гипоксии является увеличение окислительного повреждения в клетках. Целью данного протокола является использование живой визуализации для визуализации влияния окислительного повреждения на локализацию и динамику субклеточных структур в яичниках дрозофилы после индукции контролируемых клеточных повреждений. Здесь мы используем перекись водорода, чтобы вызвать клеточное окислительное повреждение и привести примеры воздействия такого повреждения на две подклеточные структуры, митохондрии и частицы блаженства Clu. Однако этот метод применим к любой субклеточной структуре. Ограничения в том, что перекись водорода может быть добавлена только в aqueous средств массовой информации и не будет работать для изображений, которые используют галоуглеродное масло. Преимущества в том, что перекись водорода легко доступна и недорога, действует быстро, ее концентрации можно модулировать, а окислительный ущерб является хорошим приближением ущерба, вызванного гипоксией, а также общего повреждения тканей в результате манипуляций.
Introduction
Несколько различных клеточных стрессоров могут возникнуть во время экспериментальной культуры и манипуляции тканями ex vivo, включая тепловой шок, окислительный стресс, осмотический стресс, питательный стресс и условия токсичности. Live imaging является мощным инструментом, используемым для визуализации изменений в тканях ex vivo в режиме реального времени после экспериментального лечения и манипуляций. Мелкие вскрытия тканей и манипуляции принимают практике, и количество времени от вскрытия до изображения может варьироваться в зависимости от опыта. Обоснование разработки этого метода основано на том, что подготовка тканей к живой визуализации может вызвать клеточный стресс во время вскрытия и подготовки изображений. Это может быть особенно проблематичным для процессов, чувствительных к изменениям клеточного метаболизма и доступных уровней кислорода, таких как митохондриальная функция. Хотя наличие параллельного образца дикого типа является важным элементом управления, по-прежнему существует вероятность того, что некоторые или все наблюдаемые изменения в субклеточных структурах могут быть вызваны повреждением или клеточным стрессом в результате вскрытия и не отражают нормальной физиологии или изучаемого лечения или мутации.
Для решения этой потенциальной проблемы мы используем добавление перекиси водорода во время живой визуализации, чтобы вызвать клеточное окислительноеповреждение 1. Цель этого метода состоит в том, чтобы вызвать повреждение тканей для того, чтобы контролировать влияние на подклеточные структуры. Этот протокол полезен для двух целей: 1) определение того, изменения в субклеточной локализации структуры интересов связано со стрессом, вызванным неопытным вскрытием и 2) после того, как исследователь уверен в методах вскрытия, описанных для мониторинга влияния контролируемой нагрузки на структуру интереса. Здесь мы покажем два примера того, как увеличение окислительного повреждения вызывает изменения в двух субклеточных структурах, митохондриях и частицах блаженства Clu. Для этого мы используем яичник Drosophila, который является общей моделью для живых исследований изображений. В первом примере рассматривается митохондриальная локализация. По нашему опыту, нормальная митохондриальная локализация в женских зародышевых клетках очень чувствительна к возмущениям и может выступать в качестве предвестника клеточного стресса. Митохондрии в drosophila женские зародышевые клетки, как правило, равномерно рассеяны по всей цитоплазмы2. Добавление перекиси водорода приводит к тому, что органеллы быстро неправильно истолковывания и кластера таким жеобразом,чтобы различные мутации 3,4,5. Вторым примером являются частицы блаженства, образованные Clueless (Clu). Clu является рибонуклеопротеин, который рассеивается по всей цитоплазмы; однако, он также образует митохондрии связанных частиц в оптимальных клеточных условиях5. Поскольку присутствие частиц Clu зависит от здоровых клеточных условий, мы назвали их “блаженство”частиц 3,5,6. Добавление перекиси водорода приводит к тому, что эти частицы быстро рассеиваются и становятся однородными в цитоплазме5. В ходе наших исследований мы наблюдали изменения в локализации обеих этих подклеточных структур, но только после проведения живых исследований изображения мы смогли в полной мере оценить влияние клеточного стресса и окислительного повреждения на локализацию и динамику митохондрий и частиц блаженства.
Полезность этого протокола как дополнения к уже установленным или альтернативным методам зависит от нескольких факторов. Во-первых, протокол изображения должен быть подотменен для добавления наркотиков. Если образец установлен под крышкой и в галоуглеродном масле, этот метод был бы не возможен7. Добавление H2O2 приводит к быстрому росту окислительного ущерба, поэтому эта шкала времени может оказаться нецелесообразной. Окислительный ущерб может рассматриваться как прокси для гипоксии; однако он может быть слишком жестким или слишком обобщенным, чтобы функционировать в качестве соответствующего контроля за ущербом для некоторых субклеточных компонентов. Наконец, для экспериментов с визуализацией, которые длятся часы, такие как эксперименты,следующие за процессом разработки,добавление H 2 O2 может быть слишком сильным (например,8). Тестирование кривой концентрации может преодолеть это ограничение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол может быть полезным дополнением в качестве контроля для артефактов из-за вскрытия яичников и инкубации тканей для любого живого эксперимента изображений. Критические шаги аналогичны тем, которые найдены для других протоколов живого изображения. Научиться вскрывать целые яичники дрозофилы требует практики; однако, этот навык обычно можно узнать довольно быстро с соответствующими инструментами вскрытия. Труднее освоить удаляет мышцы, обволакивающие яичники и каждый ovariole13. Это должно быть сделано для того, чтобы мышечные сокращения не мешали приобретению имиджа. Если использование заточенных вольфрамовых игл для этого не окажется удачным, гермариум на кончике яичника можно схватить типсами и яичником вытащили из мышечной оболочки. Тем не менее, этот метод является проблематичным, если ранние стадии развития должны быть рассмотрены, потому что они могут быть повреждены. Еще один ключевой шаг заключается в том, чтобы не выбить ovarioles опираясь на нижней части блюда при добавлении H2O2. Еще одним важным аспектом является совместное все живые изображения: исследователь должен убедиться, что структура интереса флуоресцентно хорошо помечены перед лечением. Блюда, используемые здесь(Таблица материалов )обычно используются для живой визуализации; однако, любое блюдо или слайд со стеклянной крышкой на дне или даже большой стеклянной крышкой должны работать до тех пор, как капля средств массовой информации могут быть покрыты, чтобы предотвратить испарение средств массовой информации. В то время как мы используем определенный микроскоп, любой перевернутый микроскоп с целью достаточного увеличения, чтобы увидеть подклеточную структуру в вопросе и прилагаемую камеру, которая имеет достаточное разрешение и скорость захвата изображения должны работать.
Хотя наша лаборатория в первую очередь заинтересована в митохондриальной функции, этот метод может быть полезным для изучения динамики и локализации любой подклеточной структуры или органеллы, таких как ядро, цитоскелет или эндоплазмический цитикулум. Однако этот метод имеет ограничения. Для того, чтобы добавить перекись водорода, ткань должна быть в aqueous средств массовой информации. Альтернативным методом живой визуализации является использование галоуглеродного масла, которое сыграло важную роль в описании многих важных процессов в овариолах Drosophila, включая первый пример динамического движения GFP вмодельном организме 7,14. Кроме того, добавление перекиси водорода в средства массовой информации вызывает широко распространенное окислительное повреждение, которое может быть слишком общим оскорблением для ткани, чтобы быть информативным для клеточного процесса, представляющий интерес, особенно для более длительных экспериментов, исследующих развитие. Хотя это не может быть возможным для выполнения экспериментов, которые требуют визуализации клетки в течение длительных периодов времени из-за этого быстрого, обширного и, вероятно, необратимого окислительного повреждения, мы видели, что острый перекись водорода лечение мы описали применимо к большинству этапов уогенеза, как мы можем видеть те же эффекты на большинстве этапов в течение периода времени изображения. Учитывая низкую стоимость и простоту протокола, это может быть полезным контролем за ущербом и может быть использован в качестве лечения до фиксации и маркировки антител, а также.
В наших руках, H2O2 лечение имитирует изменения в митохондриальной неправильной локализации и Clu блаженство рассеивание частиц, которые мы видим в различных мутантов Drosophila. Он также имитирует результаты, которые мы видим для новых исследователей в лабораторных методов вскрытия обучения. Таким образом, этот метод ясно показал, что подготовка образца и общий клеточный стресс может привести к неожиданным и ранее необъяснимым изменениям в митохондриальной неправильной локализации и наличии частиц блаженства. Двигая этот метод вперед, концентрации перекиси водорода могут быть модулированные с использованием более высокой или более низкой концентрации. Если клеточный эффект рассматривается с использованием более низкой концентрации, вполне возможно, стресс фенотип может быть обратимым путем замены средств массовой информации с полным Шнайдера. Различные клеточные стрессоры, такие как карбонил цианид м-хлорофенил гидразон (CCCP), арсенит или простой тепловой шок может оказаться полезным для общего клеточного стресса для других субклеточных структур. Поскольку живая визуализация тканей ex vivo требует ручных манипуляций и инкубации в различных средствах массовой информации, этот контроль должен быть полезным дополнением для обеспечения того, чтобы любые наблюдения были максимально близки к нормальной физиологии.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джереми Смита за поддержку изображений и Энн К. Шенк за иллюстрации, производство и видеосъемку. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (1R01GM127938 до R.T.C.).
Materials
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
