Visualizando os efeitos do dano oxidativo nas câmaras de ovos de Drosophila usando imagens ao vivo
Summary
O objetivo deste protocolo é utilizar imagens vivas para visualizar os efeitos dos danos oxidativos na localização e dinâmica das estruturas subcelulares nos ovários de Drosophila.
Abstract
A imagem ao vivo dos ovários de drosophila melanogaster tem sido fundamental na compreensão de uma variedade de processos celulares básicos durante o desenvolvimento, incluindo movimento de partículas de ribonucleoproteína, localização de mRNA, movimento organela e dinâmica citoesquelélenta. Existem vários métodos para imagens ao vivo que foram desenvolvidos. Devido ao fato de que cada método envolve dissecar ovários individuais colocados em mídia ou óleo de halocarbono, danos celulares devido à hipóxia e/ou manipulação física ocorrerão inevitavelmente ao longo do tempo. Um efeito a jusante da hipóxia é aumentar os danos oxidativos nas células. O objetivo deste protocolo é utilizar imagens vivas para visualizar os efeitos dos danos oxidativos na localização e dinâmica das estruturas subcelulares nos ovários de Drosophila após a indução de danos celulares controlados. Aqui, usamos peróxido de hidrogênio para induzir danos oxidativos celulares e dar exemplos dos efeitos de tais danos em duas estruturas subcelulares, mitocôndrias e partículas de felicidade clu. No entanto, este método é aplicável a qualquer estrutura subcelular. As limitações são que o peróxido de hidrogênio só pode ser adicionado à mídia aquosa e não funcionaria para imagens que usam óleo de halocarbono. As vantagens são que o peróxido de hidrogênio está prontamente disponível e barato, age rapidamente, suas concentrações podem ser moduladas, e danos oxidativos são uma boa aproximação de danos causados por hipóxia, bem como danos gerais do tecido devido à manipulação.
Introduction
Vários estressores celulares diferentes podem surgir durante a cultura experimental e manipulação de tecidos ex vivo, incluindo choque térmico, estresse oxidativo, estresse osmótico, estresse nutricional e condições de toxicidade. A imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa usada para visualizar mudanças em tempo real nos tecidos ex vivo após tratamento experimental e manipulação. Dissecções finas de tecido e manipulação tomam prática, e a quantidade de tempo de dissecção para imagem pode variar dependendo da experiência. A lógica para o desenvolvimento desse método baseia-se na preocupação de que a preparação do tecido para imagens vivas possa causar estresse celular durante a dissecção e preparação de imagens. Isso pode ser particularmente problemático para processos sensíveis a mudanças no metabolismo celular e níveis de oxigênio disponíveis, como a função mitocondrial. Embora ter uma amostra de tipo selvagem paralelo seja um controle importante, ainda há a possibilidade de que algumas ou todas as alterações observadas nas estruturas subcelulares possam ser devido a danos ou estresse celular por dissecção e não refletem a fisiologia normal ou o tratamento ou mutação que está sendo estudado.
Para resolver esse problema potencial, usamos a adição de peróxido de hidrogênio durante a imagem ao vivo, a fim de induzir danos oxidativos celulares1. O objetivo deste método é induzir danos aos tecidos, a fim de monitorar o efeito sobre estruturas subcelulares. Este protocolo é útil para dois propósitos: 1) determinar se as mudanças na localização subcelular da estrutura de interesse se devem ao estresse causado pela dissecção inexperiente e 2) uma vez que o pesquisador está confiante com as técnicas de dissecção descritas para monitorar o efeito do estresse controlado na estrutura de interesse. Aqui mostramos dois exemplos de como o aumento do dano oxidativo causa mudanças em duas estruturas subcelulares, mitocôndrias e partículas de felicidade clu. Para isso, usamos o ovário Drosophila, que é um modelo comum para estudos de imagem ao vivo. O primeiro exemplo examina a localização mitocondrial. Em nossa experiência, a localização mitocondrial normal em células germinativas femininas é altamente sensível a perturbações e pode atuar como um prenúncio do estresse celular. Mitocôndrias em células germinativas femininas de Drosophila são normalmente dispersas uniformemente ao longo do citoplasma2. A adição de peróxido de hidrogênio faz com que as organelas se deslocalizem rapidamente e se aglomeram de forma semelhante às várias mutações3,4,5. O segundo exemplo são partículas de felicidade formadas por Clueless (Clu). Clu é uma ribonucleoproteína difusa em todo o citoplasma; no entanto, também forma partículas associadas a mitocôndrias em condições celulares ideais5. Como a presença de partículas clu depende de condições celulares saudáveis, nós as chamamos de partículas de “felicidade”3,5,6. A adição de peróxido de hidrogênio faz com que essas partículas se dispersem rapidamente e se tornem homogêneas no citoplasma5. No decorrer de nossos estudos, observamos mudanças na localização de ambas as estruturas subcelulares, mas somente após a realização de estudos de imagem ao vivo poderíamos apreciar plenamente o efeito do estresse celular e danos oxidativos na localização e dinâmica das mitocôndrias e partículas de felicidade.
A utilidade deste protocolo como acréscimo a métodos já estabelecidos ou alternativos depende de vários fatores. Primeiro, o protocolo de imagem deve ser receptivo à adição de drogas. Se a amostra for montada sob uma mancha de cobertura e em óleo de halocarboneto, este método não seria possível7. A adição de H2O2 causa um rápido aumento dos danos oxidativos, portanto, essa escala de tempo pode não ser apropriada. Danos oxidativos podem ser considerados como um proxy para a hipóxia; no entanto, pode ser muito severo ou muito generalizado para funcionar como um controle apropriado para danos para certos componentes subcelulares. Finalmente, para experimentos de imagem que duram horas como aqueles que seguem um processo de desenvolvimento, a adição de H2O2 pode ser muito forte (por exemplo8). Testar uma curva de concentração pode superar essa limitação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo pode ser uma adição útil como um controle para artefatos devido à dissecção do ovário e incubação de tecidos para qualquer experimento de imagem ao vivo. Os passos críticos são semelhantes aos encontrados para outros protocolos de imagem ao vivo. Aprender a dissecar ovários drosophila inteiros requer prática; no entanto, essa habilidade geralmente pode ser aprendida rapidamente com as ferramentas de dissecção apropriadas. Mais difícil de dominar é remover o músculo envolvendo os ovários e cada ovário13. Isso deve ser feito para garantir que as contrações musculares não interfiram na aquisição de imagem. Se usar agulhas de tungstênio afiadas para fazer isso não se mostrar bem sucedido, o germário na ponta do ovário pode ser apreendido com fórceps e o ovário retirado da bainha muscular. No entanto, essa técnica é problemática para que os primeiros estágios de desenvolvimento sejam examinados porque podem ficar danificados. Outro passo fundamental é não desalojar as ovários que repousam na parte inferior do prato ao adicionar H2O2. Um aspecto importante adicional é compartilhado por todas as imagens ao vivo: o pesquisador deve garantir que a estrutura de interesse seja fluorescentemente bem rotulada antes do tratamento. Os pratos utilizados aqui (Tabela de Materiais) são comumente utilizados para imagens vivas; no entanto, qualquer prato ou slide com uma mancha de vidro na parte inferior ou mesmo uma grande mancha de vidro deve funcionar desde que a gota de mídia possa ser coberta para evitar a evaporação da mídia. Enquanto usamos um microscópio particular, qualquer microscópio invertido com um objetivo de ampliação suficiente para ver a estrutura subcelular em questão e uma câmera anexada que tenha resolução suficiente e taxa de captura de imagem deve funcionar.
Embora nosso laboratório esteja interessado principalmente na função mitocondrial, este método pode ser útil examinando a dinâmica e localização de qualquer estrutura subcelular ou organela, como o núcleo, citoesqueleto ou tiquellum endoplasmático. No entanto, esse método tem limitações. Para adicionar peróxido de hidrogênio, o tecido deve estar em uma mídia aquosa. Um método alternativo para imagens vivas é o uso de óleo de halocarbono, que tem sido fundamental para descrever muitos processos importantes em ovários de Drosophila, incluindo o primeiro exemplo de movimento dinâmico de GFP em um organismo modelo7,14. Além disso, adicionar peróxido de hidrogênio à mídia causa danos oxidativos generalizados que podem ser muito gerais um insulto ao tecido para ser informativo para o processo celular de interesse, particularmente para experimentos mais longos examinando o desenvolvimento. Embora possa não ser viável realizar experimentos que requerem visualização da célula por longos períodos de tempo devido a este dano oxidativo rápido, extenso e provavelmente irreversível, vimos que o tratamento agudo de peróxido de hidrogênio que descrevemos é aplicável à maioria dos estágios da oogênese, pois somos capazes de ver os mesmos efeitos na maioria dos estágios dentro do período de tempo de imagem. Dado o baixo custo e facilidade do protocolo, pode ser um controle útil para danos e pode ser usado como tratamento antes da fixação e rotulagem de anticorpos também.
Em nossas mãos, o tratamento H2O2 imita as mudanças na mislocalização mitocondrial e a dispersão de partículas de felicidade clu que vemos em vários mutantes de Drosophila. Também imita resultados que vemos para novos pesquisadores nas técnicas de dissecção de aprendizagem em laboratório. Portanto, este método revelou claramente que a preparação da amostra e o estresse celular geral podem levar a mudanças inesperadas e previamente inexplicáveis na mislocalização mitocondrial e na presença de partículas de felicidade. Movendo esta técnica para a frente, as concentrações de peróxido de hidrogênio poderiam ser moduladas usando uma concentração maior ou menor. Se um efeito celular for visto usando uma concentração mais baixa, é possível que o fenótipo de estresse possa ser reversível substituindo a mídia por Completa Schneider. Diferentes estressores celulares, como a hidrato de cianeto de carbonil m-clorofenil (CCCP), arsenita ou choque térmico simples podem ser úteis para o estresse celular geral para outras estruturas subcelulares. Uma vez que a imagem ao vivo dos tecidos ex vivo requer manipulação manual e incubação em diferentes mídias, este controle deve ser uma adição útil para garantir que quaisquer observações estejam o mais próxima possível da fisiologia normal.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Jeremy Smyth pelo apoio de imagem e Ann C. Shenk por ilustrações, produção e videografia. Este trabalho contou com o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (1R01GM127938 a R.T.C.).
Materials
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
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