ライブイメージングを用いたショウジョウバエ卵チャンバに対する酸化損傷の効果の可視化

1. 解剖・画像化媒体の作成 注:このライブイメージング実験に最も適したメディアには、15%の熱不活化牛胎児血清、0.6xペンストレップ、および200 μg/mLウシインスリンを含むシュナイダーのショウジョウバエ培地が含まれています。 滅菌条件下で媒体調製を行い、汚染されないようにします。メディアは、ショ ウジョウバエの 卵巣を長期間にわたってサポートするために開発されました9. シュナイダーの培地に、15%の加熱不活化牛胎児血清、0.6xペンストレップ、200 μg/mLウシインスリンを加えます。 内容をよく混ぜ、一晩4°Cで保存してください。注:インスリンは完全シュナイダーのメディアに完全に溶解しません、そしてあなたは、チューブの底に沈殿物が落ち着くのに気づくでしょう。 それはイメージングを妨げるので沈殿物を残すことを確認して、メディアのアリコートを作ります。注:このソリューションは、4°Cでアリコートに保存されている場合、1ヶ月以内に使用することができます。 解剖のための ショウジョウバエ のコレクション 注:詳細な ショウジョウバエ のコレクションと解剖手順は、Weil et al.10 およびParkerら11にも記載されています。 最適な雌の生殖細胞イメージングのために、まず、標準的なコーンミールフライ食品を含むバイアルとピーナッツバターの一貫性である湿った酵母ペーストのダブを準備します。これにより、雌のハエが十分に供給され、イメージング用のすべての卵胞発生段階が生成されます。 最適に健康なハエのために、0-1日齢のメスを収集し、濡れた酵母ペーストを含むフライフードバイアルに男性と一緒に移動します。注:睡眠ハエは、彼らがそれに固執することができるように酵母ペーストに接触しないことを確認してください。 ハエを3〜7日供給し、バイアルと酵母ペーストを毎日変更します。注:イーストペーストがフライフードに接触し、乾燥しないようにしてください。 3. ショウジョウバエ 卵巣解剖 注:過酸化水素は酸化の影響を受けやすく、TMREは時間の経過とともに劣化するため、メディア溶液を新鮮に調製することが重要です。 解剖の直前に、完全シュナイダーのメディアで、2μM H2O2 溶液の新鮮なアリコート、46 nMテトラメチルローダミンの新鮮なアリコート、エチルエステル(TMRE)、および2μMH2O2を含む46 nM TMRE溶液の新鮮なアリコートを調製する。 卵巣解剖の場合、2組の細かい鉗子と電解的に研がれたタングステン針12を使用する。卵巣を解剖するには、ガラス底の解剖皿(時計ガラス)の2〜3個の井戸を室温まで温めたコンプリートシュナイダーで満たします。 二酸化炭素で肥育ハエのバイアルを麻酔し、解剖される雌のハエの所望の数を分離する。鉗子を使用してメディアに単一のフライを置きます。 解剖顕微鏡の下で、細かい鉗子の1組を使用して胸郭によってハエをそっと握ります。他の鉗子で後部をつかみ、穏やかに引っ張って卵巣を取り除く。注:この方法を用いて卵巣がスムーズに出てこない場合、腹部全体もハエから取り除かれ、鉗子を使って腹部の両端からゆっくりと絞り出すことができます。 余分なキューティクルや組織を取り除き、新鮮な培地を含む新しい井戸に卵巣を移します。卵巣はまだ周囲の筋肉鞘から移動する必要があります。 4. 画像処理のための卵巣子を準備する 鋭利なタングステン針を使用して、周囲の筋鞘を取り除くように注意して、卵巣を優しくいじめる(図1)。 孤立した卵巣に付着した筋鞘や神経線維を軽くいじめる(図2)。注:筋鞘が取り除かれていない場合、ovarioleはぴくぴくして動き、画像取得に問題を引き起こします(ビデオ1)。 目的の細胞下構造が内因的に標識されている場合は、ステップ 4.4 に進みます。目的の構造が蛍光色素で標識される場合は、セクション5に進みます。 卵巣をきれいに解剖したら、マイクロピペットを使用して、コンプリートシュナイダーのイメージングメディアの100 μLドロップでガラス底皿のガラスのくぼみに移します。個々の卵巣は液滴の底に沈みます。 イメージングのセクション 6 に進みます。注:ミトコンドリアとClu至福の粒子をイメージングする場合、解剖の開始からイメージングまで5〜10分以下で経過するはずです。 5. ミトコンドリアをTMREで染色する 注:蛍光色素を用いたミトコンドリアの生染色に関する詳細な手順は、Parkerら 2017で見つけることができます。 ステップ4.3の後、46 nM TMRE培地の100 μLの低下で分離された卵巣をガラス底皿のガラスのくぼみに移します。個々の卵巣は液滴の底に沈みます。 室温で20分間インキュベートします。蓋をガラス底皿に置き、実験の間、皿を覆われた箱に入れ、光から守ります。注:インキュベーション後、サンプルは、無く、直接イメージすることができます。 ステップ 5.1~5.2 を繰り返して、TMRE ラベル付き卵巣子の料理を少なくとも 2 つ用意し、1 つは実験グループとして、もう 1 つはコントロールとして機能します。 6. ライブ画像の取得 ovarioles を取り付けたら、ガラス底皿の 1 つを顕微鏡に置き、必要に応じてイメージング パラメータを設定します。ここで使用されるTMREの最適な励起/発光波長は549 nm/574 nmである。 所望の視野を見つけ出した後、治療前の状態の記録として、所望の1つ以上の卵巣子の静止画または短いビデオを取得する。 7. イメージング時の過酸化水素の添加 ライブイメージングを一時停止し、ガラス底皿から蓋を取り出し、内因的にラベル付けされた構造をイメージングする場合は、マイクロピペットを使用して皿に100 μLの2μM H2O2溶液を慎重に追加します。ミトコンドリアをイメージングする場合、マイクロピペットを使用して皿に2μM H2O2溶液を用いた46 nM TMREの100μLを慎重に加える(ビデオ2)。 既存のメディアの液滴の表面を壊したり、皿の底に置き換える卵巣を置き換えないように、あまりにも速く溶液を追加することは避けてください(ビデオ2)。 皿の蓋(皿カバー)を交換し、必要に応じて目的の視野を再配置して再び焦点を合わせ、イメージングを再開します(ビデオ3、ビデオ4、図3、図4)。 実験処理が時間に敏感であるので、H2O2添加後できるだけ早くイメージングを再開するように注意してください(ビデオ5)。 必要に応じて、1 つまたは複数の卵巣子の静止画または短いビデオを取得します。これは、後処理状態の記録として機能します。 コントロールのために、2番目のガラス底皿を顕微鏡に置き、セクション6を繰り返します。 ステップ7.1を繰り返し、今度は100μLのTMRE専用メディアを皿に加えます。内因的にラベル付けされた構造をイメージングする場合は、完全シュナイダーのメディア専用ソリューションを100 μL追加します。 ステップ 7.2 と 7.3 を繰り返して、制御グループのデータを取得します。注:ミトコンドリアおよびClu至福の粒子をイメージングする場合、過酸化水素のイメージングへの添加から3〜5分以下で経過する必要があります。