הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

1. הכנת מדיית ניתוח והדמיה הערה: המדיה המתאימה ביותר לניסוי הדמיה חיה זה מכילה את המדיה Drosophila של שניידר המכילה 15% חום מומת סרום שור עוברי, 0.6x עט סטרפטוקוקוס, ו 200 מיקרוגרם / מ”ל אינסולין שור, להלן המכונה המדיה של שניידר שלם. בצע את ההכנה התקשורתית בתנאים סטריליים כדי להבטיח שהיא לא תזוהם. התקשורת פותחה כדי לתמוך Drosophila ovarioles לתקופות ממושכות של זמן9. הוסיפו 15% סרום שור עוברי מומת בחום, 0.6x Pen-Strep ואינסולין בקר 200 מיקרוגרם/מ”ל למדיה של שניידר. מערבבים היטב את התוכן ומאחסנים ב 4 מעלות צלזיוס לילה.הערה: האינסולין אינו מתמוסס לחלוטין במדיה המלאה של שניידר, ותבחינו במשקע המתיישב בתחתית הצינור. הפוך aliquots של התקשורת, להיות בטוח לעזוב את המשקעים כפי שהוא יפריע הדמיה.הערה: פתרון זה עשוי לשמש בתוך חודש אם מאוחסן aliquots ב 4 °C (69 °F). 2. אוסף דרוזופילה לניתוח הערה: ניתן למצוא גם נהלי איסוף וניתוק מפורטים של Drosophila בוייל ואח’10 ופרקר ואח’11. להדמיה אופטימלית של תאי נבט נשיים, הכינו תחילה בקבוקון המכיל מזון זבוב קמח תירס סטנדרטי וקצת משחת שמרים רטובה שהיא עקביות של חמאת בוטנים. פעולה זו מבטיחה שהזבובים הנשיים יוזנו היטב וייצרו את כל שלבי התפתחות הזקיק להדמיה. עבור זבובים בריאים אופטימלית, לאסוף נקבות 0-1 יום והעברה עם זכרים לתוך בקבוקון מזון זבוב המכיל הדבק שמרים רטובים.הערה: ודא זבובים ישנים לא ליצור קשר עם הדבק שמרים כפי שהם יכולים לדבוק בו. להאכיל את הזבובים 3-7 ימים, שינוי הבקבוקון ואת הדבק שמרים מדי יום.הערה: ודא את הדבק שמרים קשר מזון לטוס כך שהוא לא להתייבש. 3. ניתוח שחלות דרוזופילה הערה: חשוב להכין את פתרונות המדיה טריים כי מי חמצן רגישים חמצון TMRE משפיל לאורך זמן. ממש לפני הניתוח, במדיה של שלם שניידר, להכין aliquot טרי של 2 μM H2O2 פתרון, aliquot טרי של 46 nM tetramethylrhodamine, אתיל אסתר (TMRE), ו aliquot טרי של פתרון 46 nM TMRE המכיל 2 מיקרומטר H2O2. לניתוח השחלות, השתמשו בשני זוגות מלקחיים עדינים וזוג מחטי טונגסטן מחודדות אלקטרוליטיות12. כדי לנתח את השחלות, מלאו 2-3 בארות של צלחת ניתוח תחתית זכוכית (זכוכית שעון) עם שלם שניידר שהתחמם לטמפרטורת החדר. הרדמה של בקבוקון של זבובים משומנים עם פחמן דו חמצני ולהפריד את המספר הרצוי של זבובים נקבה להיות מנותח. מקם זבוב בודד במדיה באמצעות מלקחיים. תחת מיקרוסקופ מנתח, בעדינות לתפוס את הזבוב על ידי בית החזה באמצעות זוג אחד של מלקחיים עדינים. עם זוג מלקחיים אחרים, לתפוס את האחורי, בעדינות למשוך כדי להסיר את השחלות.הערה: אם השחלות אינן יוצאות בצורה חלקה בשיטה זו, ניתן גם להסיר את הבטן כולה מהעף, ואת השחלות ניתן לסחוט בעדינות משני קצה הבטן באמצעות מלקחיים. הסר כל קוטיקולה או רקמה חוץ גופית, ולאחר מכן להעביר את השחלות לבאר חדשה המכילה מדיה טרייה. השחלות עדיין צריכות לנוע ממעטפת השרירים שמסביב. 4. הכנת אובריול להדמיה באמצעות מחטי טונגסטן מחודדות, להקניט בעדינות את ovarioles לגזרים, מקפיד להסיר את נדן השריר שמסביב (איור 1). להקניט בעדינות את כל נדן השרירים וסיבי העצב המחוברים לאובריולס המבודדים(איור 2).הערה: אם נדן השריר אינו מוסר, ovariole יהיה עווית ולזוז, גרימת בעיות עם רכישת תמונה (וידאו 1). אם המבנים התת-תאיים בעלי העניין מסומנים באופן אנדוגני, המשך לשלב 4.4. אם מבני העניין יסומנו בצבע פלואורסצנטי, המשך לסעיף 5. לאחר ovarioles כבר נותחו בצורה נקייה, באמצעות micropipette, להעביר אותם טיפה 100 μL של מדיה הדמיה של מלא שניידר לתוך דיכאון זכוכית של צלחת תחתית זכוכית. ovarioles בודדים ישקע לתחתית הטרופ. המשך לסעיף 6 להדמיה.הערה: להדמיית חלקיקי מיטוכונדריה וקלו, לא יותר מחמש-עשר דקות אמורות לחלוף מתחילת הניתוח ועד להדמיה. 5. מיטוכונדריה מכתימה עם TMRE הערה: נהלים מפורטים נוספים על כתמים חיים של המיטוכונדריה עם צבעים פלואורסצנטיים ניתן למצוא פארקר ואח ‘. 2017. לאחר שלב 4.3, להעביר את ovarioles מבודד טיפה 100 μL של 46 nM TMRE מדיה לתוך דיכאון זכוכית של צלחת תחתית זכוכית. ovarioles בודדים ישקע לתחתית הטרופ. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. מניחים את המכסה על צלחת תחתית הזכוכית ומניחים את המנה בקופסה מכוסה למשך הניסוי כדי להגן מפני אור.הערה: לאחר הדגירה, ניתן לדמיין דגימות ישירות ללא שטיפות. חזור על שלבים 5.1-5.2 כדי להכין לפחות שתי מנות של ovarioles שכותרתו TMRE, אחד לשמש כקבוצה ניסיונית ואחד לשמש שליטה. 6. רכישת תמונה חיה לאחר ovarioles מותקן, מניחים את אחת הכלים התחתונים זכוכית על המיקרוסקופ ולהגדיר את הפרמטרים הדמיה לפי הצורך. אורכי הגל האופטימליים של עירור/פליטה עבור TMRE המשמשים כאן הם 549 ננומטר/574 ננומטר. לאחר איתור שדה הראייה הרצוי, לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים של ovarioles אחד או יותר לפי הצורך כמו תיעוד של תנאים טרום טיפול. 7. תוספת של מי חמצן במהלך ההדמיה השהה הדמיה חיה, הסר את המכסה מהתבנית התחתונה של הזכוכית, והוסף בזהירות 100 μL של 2 μM H2O2 פתרון לצלחת באמצעות micropipette אם הדמיה מבנים מסומנים אנדוגני. אם הדמיה המיטוכונדריה, בזהירות להוסיף 100 μL של 46 nM TMRE עם 2 μM H2O2 פתרון לצלחת באמצעות micropipette (וידאו 2). הימנע משבירת פני השטח של טיפת המדיה הקיימת או הוספת הפתרון מהר מדי כדי לא לעקור את ovarioles נח על החלק התחתון של המנה (וידאו 2). החליפו את מכסה המנה (כיסוי כלים), החליפו מחדש את שדה הראייה הרצוי ומיקדו אותו מחדש במידת הצורך, וחידשו את ההדמיה (וידאו 3, וידאו 4, איור 3, איור 4). יש להקפיד לחדש את ההדמיה במהירות האפשרית לאחר תוספת H2O2 מכיוון שהטיפול הניסיוני רגיש לזמן (וידאו 5). לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים של ovarioles אחד או יותר לפי הצורך. זה ישמש כתיעוד של תנאים שלאחר הטיפול. לשליטה, מניחים את צלחת תחתית הזכוכית השנייה על המיקרוסקופ וחוזרים על סעיף 6. חזור על שלב 7.1, הפעם הוספת 100 μL של מדיה TMRE בלבד למנה. אם דימות מבנים המסומנים באופן אנדוגני, הוסף 100 μL של פתרון המדיה בלבד של המלאי שניידר. חזור על שלבים 7.2 ו- 7.3 כדי להשיג נתונים עבור קבוצת הביקורת.הערה: להדמיית חלקיקי מיטוכונדריה וקלו, לא יותר משלוש-חמש דקות אמורות לחלוף מהתוספת של מי חמצן להדמיה.