Visualisation des effets des dommages oxydatifs sur les chambres d'oeufs Drosophila à l'aide de l'imagerie en direct

1. Préparation de la dissection et des supports d’imagerie REMARQUE : Les supports les mieux adaptés à cette expérience d’imagerie en direct contiennent les supports Drosophila de Schneider contenant 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par chaleur, 0,6 x Pen-Strep et 200 μg/mL d’insuline bovine, appelée ci-après les médias de Complete Schneider. Effectuer la préparation des médias dans des conditions stériles pour s’assurer qu’il ne soit pas contaminé. Les médias ont été développés pour soutenir Drosophila ovarioles pendant de longues périodes de temps9. Ajouter 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 0,6 x Pen-Strep et 200 μg/mL d’insuline bovine aux médias du Schneider. Bien mélanger le contenu et le conserver à 4 °C toute la nuit.REMARQUE : L’insuline ne se dissout pas complètement dans les médias de Complete Schneider, et vous remarquerez qu’un précipité s’installe au fond du tube. Faites des aliquots des médias, en étant sûr de quitter le précipité car il interférera avec l’imagerie.REMARQUE : Cette solution peut être utilisée dans un délai d’un mois si elle est stockée dans des aliquots à 4 °C. 2. Collection de Drosophile pour la dissection REMARQUE : Des procédures détaillées de collecte et de dissection de Drosophila peuvent également être trouvées dans Weil et coll.10 et Parker et coll.11. Pour une imagerie optimale des cellules germinales féminines, préparez d’abord un flacon contenant des aliments standard pour la mouche de la semoule de maïs et une touche de pâte de levure humide qui est la consistance du beurre d’arachide. Cela garantit que les mouches femelles sont bien nourries et produiront tous les stades de développement des follicules pour l’imagerie. Pour les mouches en parfaite santé, recueillir les femelles de 0-1 jour et transférer avec les mâles dans un flacon de nourriture mouche contenant de la pâte de levure humide.REMARQUE : Assurez-vous que les mouches endormies ne contactent pas la pâte de levure car elles peuvent s’y tenir. Nourrir les mouches 3-7 jours, en changeant le flacon et la pâte de levure tous les jours.REMARQUE : Assurez-vous que la pâte de levure entre en contact avec les aliments à la mouche afin qu’ils ne se dessèchent pas. 3. Dissection de l’ovaire Drosophila REMARQUE : Il est important de préparer les solutions multimédias fraîches parce que le peroxyde d’hydrogène est sensible à l’oxydation et que tmre se dégrade avec le temps. Juste avant la dissection, dans les médias de Complete Schneider, préparez un aliquot frais de 2 μM H2O2 solution, un aliquot frais de 46 nM tétramethylrhodamine, ester éthylique (TMRE), et un aliquot frais d’une solution TMRE de 46 nM contenant 2 μM H2O2. Pour la dissection des ovaires, utilisez deux paires de forceps fins et une paire d’aiguilles de tungstène électrolytiquement aiguisées12. Pour disséquer les ovaires, remplissez 2-3 puits d’un plat de dissecting de fond de verre (verre de montre) avec le Schneider complet qui a été réchauffé à la température ambiante. Anesthésier le flacon de mouches engraissées avec du dioxyde de carbone et séparer le nombre désiré de mouches femelles à disséquer. Placez une seule mouche dans les médias à l’aide de forceps. Sous un microscope disséquant, saisissez doucement la mouche par le thorax à l’aide d’une paire de forceps fins. Avec l’autre paire de forceps, saisir le postérieur, et tirer doucement pour enlever les ovaires.REMARQUE: si les ovaires ne sortent pas en douceur en utilisant cette méthode, l’abdomen entier peut également être retiré de la mouche, et les ovaires peuvent être doucement pressés de chaque extrémité de l’abdomen à l’aide de forceps. Enlevez toute cuticule ou tissu extraneous, puis transférez les ovaires à un nouveau puits contenant des médias frais. Les ovaires devraient encore se déplacer de la gaine musculaire environnante. 4. Préparation des ovarioles à l’imagerie À l’aide d’aiguilles de tungstène aiguisées, taquiner délicatement les ovarioles, en prenant soin d’enlever la gaine musculaire environnante (figure 1). Taquinez doucement toute gaine musculaire et fibres nerveuses attachées aux ovarioles isolés (Figure 2).REMARQUE : Si la gaine musculaire n’est pas enlevée, l’ovariole se contracte et se déplace, causant des problèmes d’acquisition d’image (Vidéo 1). Si les structures subcellulaires d’intérêt sont étiquetées de façon endogène, passez à l’étape 4.4. Si les structures d’intérêt sont étiquetées avec un colorant fluorescent, passez à l’article 5. Une fois que les ovarioles ont été disséqués proprement, à l’aide d’une micropipette, transférez-les dans une goutte de 100 μL du média d’imagerie complete Schneider dans la dépression de verre d’un plat de fond en verre. Les ovarioles individuels descendront au fond de la gouttelette. Passez à la section 6 pour l’imagerie.REMARQUE : Pour l’imagerie des mitochondries et des particules de bonheur Clu, pas plus de cinq à dix minutes devraient s’écouler du début de la dissection à l’imagerie. 5. Coloration des mitochondries avec TMRE REMARQUE : D’autres procédures détaillées sur la coloration vivante des mitochondries avec des colorants fluorescents peuvent être trouvées dans Parker et coll. 2017. Après l’étape 4.3, transférez les ovarioles isolés dans une baisse de 100 μL de 46 nM TMRE médias dans la dépression de verre d’un plat de fond en verre. Les ovarioles individuels descendront au fond de la gouttelette. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Placez le couvercle sur le plat à fond de verre et placez le plat dans une boîte couverte pendant toute la durée de l’expérience pour vous protéger de la lumière.REMARQUE : Après l’incubation, les échantillons peuvent être photographiés directement sans lavage. Répétez les étapes 5.1-5.2 pour préparer au moins deux plats d’ovarioles étiquetés TMRE, l’un pour servir de groupe expérimental et l’autre pour servir de contrôle. 6. Acquisition d’images en direct Une fois que les ovarioles sont montés, placez l’une des plats de fond en verre sur le microscope et configurez les paramètres d’imagerie au besoin. Les longueurs d’onde optimales excitation/émission pour le TMRE utilisé ici sont 549 nm/574 nm. Après avoir localé le champ de vision désiré, acquérir des images fixes ou de brèves vidéos d’un ou plusieurs ovarioles comme souhaité comme un enregistrement des conditions de pré-traitement. 7. Ajout de peroxyde d’hydrogène pendant l’imagerie Mettez en pause l’imagerie en direct, retirez le couvercle du plat inférieur en verre et ajoutez soigneusement 100 μL de solution H 2 O2 μMau plat à l’aide d’une micropipette si l’imagerie est étiquetée de façon endogène. Si l’imagerie mitochondrie, ajouter soigneusement 100 μL de 46 nM TMRE avec 2 μM H2O2 solution au plat à l’aide d’une micropipette (Vidéo 2). Évitez de casser la surface de la gouttelette multimédia existante ou d’ajouter la solution trop rapidement afin de ne pas déplacer les ovarioles reposant sur le fond du plat (Vidéo 2). Remplacer le couvercle du plat (couvercle de plat), déplacer et recentrer le champ de vision désiré si nécessaire, et reprendre l’imagerie (Vidéo 3, Vidéo 4, Figure 3, Figure 4). Prenez soin de reprendre l’imagerie le plus rapidement possible aprèsl’ajout deH 2 O2 car le traitement expérimental est sensible au temps (Vidéo 5). Obtenez des images fixes ou de brèves vidéos d’un ou plusieurs ovarioles comme vous le souhaitez. Cela servira d’enregistrement des conditions post-traitement. Pour le contrôle, placez le deuxième plat de fond en verre sur le microscope et répétez la section 6. Répétez l’étape 7.1, cette fois en ajoutant 100 μL de médias TMRE uniquement au plat. Si l’imagerie est étiquetée de façon endogène, ajoutez 100 μL de la solution multimédia de Complete Schneider. Répétez les étapes 7.2 et 7.3 pour acquérir des données pour le groupe témoin.REMARQUE : Pour les mitochondries d’imagerie et les particules de bonheur Clu, pas plus de trois-cinq minutes devraient s’écouler de l’ajout de peroxyde d’hydrogène à l’imagerie.