Visualiseren van de effecten van oxidatieve schade op Drosophila Egg Chambers met behulp van Live Imaging
Summary
Het doel van dit protocol is om live imaging te gebruiken om de effecten van oxidatieve schade op de lokalisatie en dynamiek van subcellulaire structuren in Drosophila eierstokken te visualiseren.
Abstract
Live beeldvorming van Drosophila melanogaster eierstokken heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van een verscheidenheid aan basis cellulaire processen tijdens de ontwikkeling, waaronder ribonucleoproteïne deeltjesbeweging, mRNA-lokalisatie, organellenbeweging en cytoskeletdynamiek. Er zijn verschillende methoden voor live beeldvorming ontwikkeld. Vanwege het feit dat elke methode betrekking heeft op het ontleden van individuele ovarioles die in media of halocarbonolie zijn geplaatst, zal cellulaire schade als gevolg van hypoxie en/of fysieke manipulatie onvermijdelijk na verloop van tijd optreden. Een downstream-effect van hypoxie is het verhogen van oxidatieve schade in de cellen. Het doel van dit protocol is om live beeldvorming te gebruiken om de effecten van oxidatieve schade op de lokalisatie en dynamiek van subcellulaire structuren in Drosophila-eierstokken te visualiseren na inductie van gecontroleerde cellulaire schade. Hier gebruiken we waterstofperoxide om cellulaire oxidatieve schade op te wekken en geven we voorbeelden van de effecten van dergelijke schade op twee subcellulaire structuren, mitochondriën en Clu bliss-deeltjes. Deze methode is echter van toepassing op elke subcellulaire structuur. De beperkingen zijn dat waterstofperoxide alleen kan worden toegevoegd aan waterige media en niet zou werken voor beeldvorming die halokoolstofolie gebruikt. De voordelen zijn dat waterstofperoxide direct beschikbaar en goedkoop is, snel werkt, de concentraties ervan kunnen worden gemoduleerd en oxidatieve schade een goede benadering is van schade veroorzaakt door hypoxie en algemene weefselschade als gevolg van manipulatie.
Introduction
Meerdere verschillende cellulaire stressoren kunnen ontstaan tijdens de experimentele kweek en manipulatie van weefsels ex vivo, waaronder hitteschok, oxidatieve stress, osmotische stress, voedingsstress en toxiciteitsomstandigheden. Live imaging is een krachtig hulpmiddel dat wordt gebruikt om real-time veranderingen in ex vivo weefsels te visualiseren na experimentele behandeling en manipulatie. Fijne weefseldissecties en manipulatie nemen oefening in, en de hoeveelheid tijd van dissectie tot beeldvorming kan variëren afhankelijk van de ervaring. De reden voor het ontwikkelen van deze methode is gebaseerd op de zorg dat het voorbereiden van weefsel op levende beeldvorming cellulaire stress kan veroorzaken tijdens dissectie en beeldvormingsvoorbereiding. Dit kan met name problematisch zijn voor processen die gevoelig zijn voor veranderingen in het cellulaire metabolisme en het beschikbare zuurstofgehalte, zoals de mitochondriale functie. Hoewel het hebben van een parallel wild type monster een belangrijke controle is, is er nog steeds de mogelijkheid dat sommige of alle waargenomen veranderingen in subcellulaire structuren te wijten kunnen zijn aan schade of celstress door dissectie en geen normale fysiologie weerspiegelen of de behandeling of mutatie die wordt bestudeerd.
Om dit potentiële probleem aan te pakken, gebruiken we waterstofperoxidetoevoeging tijdens live beeldvorming om cellulaire oxidatieve schade op te wekken1. Het doel van deze methode is om weefselschade aan te brengen om het effect op subcellulaire structuren te controleren. Dit protocol is nuttig voor twee doeleinden: 1) bepalen of veranderingen in subcellulaire lokalisatie van de structuur van belang te wijten zijn aan de stress veroorzaakt door onervaren dissectie en 2) zodra de onderzoeker vertrouwen heeft in de beschreven dissectietechnieken om het effect van gecontroleerde stress op de structuur van belang te monitoren. Hier laten we twee voorbeelden zien van hoe verhoogde oxidatieve schade veranderingen veroorzaakt in twee subcellulaire structuren, mitochondriën en Clu bliss deeltjes. Om dit te doen, gebruiken we de Drosophila-eierstok, een gemeenschappelijk model voor live beeldvormingsstudies. Het eerste voorbeeld onderzoekt mitochondriale lokalisatie. Onze ervaring is dat normale mitochondriale lokalisatie in vrouwelijke kiemcellen zeer gevoelig is voor verstoringen en kan fungeren als een voorbode van cellulaire stress. Mitochondriën in Drosophila vrouwelijke kiemcellen zijn normaal gesproken gelijkmatig verspreid over het cytoplasma2. Toevoeging van waterstofperoxide zorgt ervoor dat de organellen snel verkeerd worden gelokaliseren en clusteren op een vergelijkbare manier als verschillendemutaties 3,4,5. Het tweede voorbeeld zijn gelukzaligheidsdeeltjes gevormd door Clueless (Clu). Clu is een ribonucleoproteïne dat diffuus is in het cytoplasma; het vormt echter ook mitochondriën-geassocieerde deeltjes onder optimale cellulaire omstandigheden5. Omdat de aanwezigheid van Clu-deeltjes afhankelijk is van gezonde cellulaire omstandigheden, hebben we ze “gelukzaligheidsdeeltjes”genoemd 3,5,6. Toevoeging van waterstofperoxide zorgt ervoor dat deze deeltjes zich snel verspreiden en homogeen worden in het cytoplasma5. In de loop van onze studies hebben we veranderingen waargenomen in de lokalisatie van beide subcellulaire structuren, maar pas na het uitvoeren van live beeldvormingsstudies konden we het effect van cellulaire stress en oxidatieve schade op lokalisatie en dynamiek van mitochondriën en gelukzaligheidsdeeltjes volledig waarderen.
Het nut van dit protocol als aanvulling op reeds vastgestelde of alternatieve methoden hangt af van verschillende factoren. Ten eerste moet het beeldvormingsprotocol vatbaar zijn voor drugstoevoeging. Indien het monster onder een afdeklip en in halocarbonolie wordt gemonteerd, zou deze methode niet mogelijk zijn7. H2O2 toevoeging veroorzaakt een snelle toename van oxidatieve schade, daarom is deze termijn mogelijk niet geschikt. Oxidatieve schade kan worden beschouwd als een proxy voor hypoxie; het kan echter te hard of te veralgemeend zijn om te functioneren als een geschikte controle voor schade voor bepaalde subcellulaire componenten. Ten slotte kan voor beeldvormingsexperimenten die uren duren, zoals die na een ontwikkelingsproces, de toevoeging H2O2 te sterk zijn (bijvoorbeeld8). Het testen van een concentratiecurve kan deze beperking overwinnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol kan een nuttige toevoeging zijn als controle voor artefacten als gevolg van eierstokdissectie en weefselincub incubatie voor elk live beeldvormingsexperiment. De kritieke stappen zijn vergelijkbaar met die voor andere live imaging-protocollen. Het leren ontleden van hele Drosophila eierstokken vergt oefening; deze vaardigheid kan echter meestal vrij snel worden geleerd met de juiste dissectietools. Moeilijker onder de knie te krijgen is het verwijderen van de spier die de eierstokken omhult en elke eierstok13. Dit moet worden gedaan om ervoor te zorgen dat spiercontracties de beeldverwerving niet verstoren. Als het gebruik van geslepen wolfraamnaalden om dit te doen niet succesvol blijkt, kan het kiemarium aan de punt van de ovariole worden vastgegrepen met een tang en de ovariole uit de spierhuls worden getrokken. Deze techniek is echter problematisch als de vroegste ontwikkelingsstadia moeten worden onderzocht omdat ze beschadigd kunnen raken. Een andere belangrijke stap is om de ovarioles die op de bodem van het gerecht rusten niet los te maken bij het toevoegen van H2O2. Een extra belangrijk aspect wordt gedeeld door alle live beeldvorming: de onderzoeker moet ervoor zorgen dat de structuur van belang fluorescerend goed gelabeld is voor de behandeling. De gerechten die hier worden gebruikt (Table of Materials) worden vaak gebruikt voor live beeldvorming; een schotel of glijbaan met een glazen afdeklip aan de onderkant of zelfs een grote glazen hoeslip moet echter werken zolang de druppel media kan worden afgedekt om verdamping van media te voorkomen. Terwijl we een bepaalde microscoop gebruiken, zou elke omgekeerde microscoop met een doel van voldoende vergroting om de betreffende subcellulaire structuur te zien en een bijgevoegde camera met voldoende resolutie en beeldopnamesnelheid moeten werken.
Hoewel ons laboratorium voornamelijk geïnteresseerd is in mitochondriale functie, kan deze methode nuttig zijn om de dynamiek en lokalisatie van elke subcellulaire structuur of organel te onderzoeken, zoals de kern, cytoskelet of endoplasmatisch reticulum. Deze methode heeft echter beperkingen. Om waterstofperoxide toe te voegen, moet het weefsel zich in een waterig medium zijn. Een alternatieve methode voor live beeldvorming is het gebruik van halocarbonolie, die een belangrijke rol heeft gespeeld bij het beschrijven van vele belangrijke processen in Drosophila-ovarioles, waaronder het eerste voorbeeld van dynamische beweging van GFP in een modelorganisme7,14. Bovendien veroorzaakt het toevoegen van waterstofperoxide aan de media wijdverspreide oxidatieve schade die een te algemene belediging voor het weefsel kan zijn om informatief te zijn voor het cellulaire proces van belang, met name voor langere experimenten die de ontwikkeling onderzoeken. Hoewel het misschien niet haalbaar is om experimenten uit te voeren waarvoor de cel gedurende lange tijd moet worden gevisualiseerd vanwege deze snelle, uitgebreide en waarschijnlijk onomkeerbare oxidatieve schade, hebben we gezien dat de acute waterstofperoxidebehandeling die we hebben beschreven van toepassing is op de meeste stadia van oogenese, omdat we in de meeste stadia binnen de beeldvormingsperiode dezelfde effecten kunnen zien. Gezien de lage kosten en het gemak van het protocol, kan het een nuttige controle zijn voor schade en kan het ook worden gebruikt als een behandeling vóór fixatie en antilichaametikettering.
In onze handen bootst de H2O2-behandeling de veranderingen in mitochondriale mislocatie en Clu bliss deeltjesdispersie na die we zien in verschillende Drosophila-mutanten. Het bootst ook resultaten na die we zien voor nieuwe onderzoekers in het lab die dissectietechnieken leren. Daarom toonde deze methode duidelijk aan dat monstervoorbereiding en algemene cellulaire stress kunnen leiden tot onverwachte en eerder onverklaarbare veranderingen in mitochondriale mislocatie en de aanwezigheid van gelukzaligheidsdeeltjes. Door deze techniek vooruit te helpen, kunnen waterstofperoxideconcentraties worden gemoduleerd met een hogere of lagere concentratie. Als een cellulair effect wordt gezien met een lagere concentratie, is het mogelijk dat het stressfenotype omkeerbaar is door het medium te vervangen door dat van Complete Schneider. Verschillende celstressoren zoals carbonylcyanide m-chlorofenylhydrazon (CCCP), arseen of eenvoudige hitteschok kunnen nuttig zijn voor algemene cellulaire stress voor andere subcellulaire structuren. Aangezien live beeldvorming van ex vivo weefsels manuele manipulatie en incubatie in verschillende media vereist, moet deze controle een nuttige aanvulling zijn om ervoor te zorgen dat eventuele waarnemingen zo dicht mogelijk bij de normale fysiologie liggen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Jeremy Smyth bedanken voor beeldvormingsondersteuning en Ann C. Shenk voor illustraties, productie en videografie. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (1R01GM127938 t.n.v. R.T.C.).
Materials
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
