تصور آثار الضرر التأسدي على غرف البيض Drosophila باستخدام التصوير الحي
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام التصوير الحي لتصور آثار الضرر التأكيدي على توطين وديناميات الهياكل دون الخلوية في المبيضين Drosophila.
Abstract
التصوير الحي للمبايض Drosophila الميلانوغاستر كان له دور فعال في فهم مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية الأساسية أثناء التطوير ، بما في ذلك حركة جزيئات ribonucleoprotein ، وتوطين مرنا ، وحركة العضية ، وديناميكيات الهيكل العظمي. هناك عدة طرق للتصوير الحي تم تطويرها. يرجع ذلك إلى حقيقة أن كل طريقة ينطوي على تشريح ovarioles الفردية وضعت في وسائل الإعلام أو زيت الهالوكربون, الضرر الخلوية بسبب نقص الأكسجة و / أو التلاعب المادي سيحدث حتما مع مرور الوقت. تأثير واحد المصب من نقص الأكسجة هو زيادة الضرر التأكسي في الخلايا. الغرض من هذا البروتوكول هو استخدام التصوير الحي لتصور آثار الضرر التأكيدي على توطين وديناميات الهياكل دون الخلوية في مبايض Drosophila بعد تحريض التلف الخلوي الخاضع للرقابة. هنا، نستخدم بيروكسيد الهيدروجين للحث على تلف الأكسدة الخلوية وإعطاء أمثلة على آثار هذا الضرر على اثنين من الهياكل دون الخلوية، الميتوكوندريا وجزيئات النعيم كلو. ومع ذلك، هذا الأسلوب قابل للتطبيق على أي بنية الخلية الفرعية. القيود هي أن بيروكسيد الهيدروجين لا يمكن إلا أن تضاف إلى وسائل الإعلام مائي ولن تعمل للتصوير الذي يستخدم زيت الهالوكربون. وتتمثل المزايا التي بيروكسيد الهيدروجين هو متاح بسهولة وغير مكلفة، ويعمل بسرعة، ويمكن تعديل تركيزاتها، والضرر التأكسي هو تقريب جيد من الضرر الناجم عن نقص الأكسجة وكذلك تلف الأنسجة العامة بسبب التلاعب.
Introduction
قد تنشأ العديد من الضغوطات الخلوية المختلفة خلال الثقافة التجريبية والتلاعب في الأنسجة السابقة فيفو، بما في ذلك صدمة الحرارة، والإجهاد التأ المؤسد، والإجهاد التناضح، والإجهاد الغذائي، وظروف السمية. التصوير الحي هو أداة قوية تستخدم لتصور التغيرات في الوقت الحقيقي في الأنسجة الحية السابق بعد العلاج التجريبي والتلاعب. تشريح الأنسجة الدقيقة والتلاعب تأخذ الممارسة، ومقدار الوقت من تشريح للتصوير يمكن أن تختلف تبعا للتجربة. ويستند الأساس المنطقي لتطوير هذه الطريقة على القلق من أن إعداد الأنسجة للتصوير الحي يمكن أن يسبب الإجهاد الخلوي أثناء تشريح وإعداد التصوير. ويمكن أن يكون هذا مشكلة خاصة بالنسبة للعمليات الحساسة للتغيرات في التمثيل الغذائي الخلوي ومستويات الأكسجين المتاحة، مثل وظيفة الميتوكوندريا. في حين أن وجود عينة من نوع البرية موازية هو عنصر تحكم مهم، لا يزال هناك احتمال أن بعض أو كل التغيرات الملاحظة في الهياكل دون الخلوية يمكن أن يكون بسبب تلف أو ضغط الخلية من تشريح ولا تعكس علم وظائف الأعضاء الطبيعي أو العلاج أو الطفرة التي يجري دراستها.
لمعالجة هذه المشكلة المحتملة، ونحن نستخدم بيروكسيد الهيدروجين بالإضافة أثناء التصوير الحي من أجل الحث على الضرر الأكسدةالخلوية 1. والغرض من هذه الطريقة هو الحث على تلف الأنسجة من أجل رصد تأثير على الهياكل دون الخلوية. هذا البروتوكول مفيد لغرضين: 1) تحديد ما إذا كانت التغييرات في توطين دون الخلوية من هيكل الفائدة بسبب الإجهاد الناجم عن تشريح عديم الخبرة و 2) مرة واحدة الباحث واثق مع تقنيات التشريح الموصوفة لرصد تأثير الإجهاد الخاضع للرقابة على هيكل الفائدة. هنا نعرض مثالين عن كيفية زيادة الضرر التأسدي يسبب تغييرات في اثنين من الهياكل دون الخلوية، الميتوكوندريا وجزيئات النعيم كلو. للقيام بذلك، نستخدم المبيض Drosophila وهو نموذج شائع لدراسات التصوير الحي. أول مثال يفحص التعريب الميتوكوندريا. في تجربتنا، توطين الميتوكوندريا العادي في الخلايا الجرثومية الأنثوية حساس للغاية للانزعاج ويمكن أن يكون بمثابة نذير للإجهاد الخلوي. الميتوكوندريا في الخلايا الجرثومية الإناث Drosophila عادة ما تكون موزعة بالتساوي في جميع أنحاء السيتوبلازم2. إضافة بيروكسيد الهيدروجين يسبب organelles إلى سوء الموقع بسرعة وتكتل بطريقة مماثلة لمختلف الطفرات3,4,5. المثال الثاني هي جسيمات النعيم التي شكلتها جاهل (Clu). Clu هو بروتين ريبونوكليوبروتين منتشر في جميع أنحاء السيتوبلازم; ومع ذلك، فإنه يشكل أيضا الجسيمات المرتبطة الميتوكوندريا في ظل الظروف الخلوية المثلى5. لأن وجود جسيمات Clu يعتمد على الظروف الخلوية الصحية ، فقد اصطلحنا على تسميتها “النعيم” الجسيمات3،5،6. إضافة بيروكسيد الهيدروجين يسبب هذه الجسيمات لتفريق بسرعة وتصبح متجانسة في السيتوبلازم5. في سياق دراساتنا ، لاحظنا تغييرات في توطين كل من هذه الهياكل دون الخلوية ، ولكن فقط بعد إجراء دراسات التصوير الحية يمكننا أن نقدر تمامًا تأثير الإجهاد الخلوي والضرر التأكيدي على التوطين وديناميات الميتوكوندريا والجسيمات.
10- إن فائدة هذا البروتوكول بوصفه إضافة إلى الأساليب التي سبق إنشاؤها أو بديلة تتوقف على عدة عوامل. أولاً، يجب أن يكون بروتوكول التصوير قابلاً لإضافة الأدوية. إذا تم تركيب العينة تحت غطاء وفي زيت الهالوكربون، فإن هذه الطريقة لن تكون ممكنة7. H2O2 بالإضافة إلى أسباب ارتفاع سريع في الضرر التأ المؤكد، وبالتالي، قد لا يكون هذا الجدول الزمني المناسب. ويمكن اعتبار الضرر التأكسي وكيلا عن نقص الأكسجة؛ ومع ذلك، قد يكون قاسية جداً أو معممة جداً لتعمل كعنصر تحكم مناسب لتلف بعض المكونات دون الخلية. وأخيراً، بالنسبة لتجارب التصوير التي تستمر ساعات مثل تلك التي تتبع عملية تطويرية، قد تكون إضافة H2O2 قوية جدًا (على سبيل المثال8). اختبار منحنى تركيز قد التغلب على هذا القيد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يكون هذا البروتوكول إضافة مفيدة كتحكم في القطع الأثرية بسبب تشريح المبيض وحضانة الأنسجة لأي تجربة تصوير حية. تشبه الخطوات الهامة تلك التي تم العثور عليها لبروتوكولات التصوير الحي الأخرى. تعلم كيفية تشريح المبيضين دروسوفيليا كله يأخذ الممارسة; ومع ذلك، يمكن عادةً تعلم هذه المهارة بسرعة إلى حد ما مع أدوات التشريح المناسبة. أكثر صعوبة لإتقان هو إزالة العضلات تغلف المبيضين وكل ovariole13. يجب القيام بذلك لضمان تقلصات العضلات لا تتداخل مع الحصول على صورة. إذا كان استخدام الإبر التنغستن شحذ للقيام بذلك لا يثبت نجاحها، يمكن استيعاب الجرثومة في غيض من ovariole مع ملقط و ovariole سحبت من مغد العضلات. ومع ذلك، هذه التقنية هي إشكالية إذا كانت المراحل التنموية الأولى هي التي يتعين فحصها لأنها يمكن أن تصبح معطوبة. خطوة رئيسية أخرى هي عدم طرد ovarioles يستريح على الجزء السفلي من الطبق عند إضافة H2O2. وهناك جانب هام إضافي مشترك بين جميع التصوير الحي: يجب على الباحث التأكد من أن هيكل الاهتمام هو الفلورسنت المسمى جيدا قبل العلاج. الأطباق المستخدمة هنا (جدول المواد) تستخدم عادة للتصوير الحي . ومع ذلك، أي طبق أو الشريحة مع غطاء زجاجي على الجزء السفلي أو حتى غطاء زجاجي كبير يجب أن تعمل طالما يمكن تغطية قطرة من وسائل الإعلام لمنع تبخر وسائل الإعلام. بينما نستخدم مجهر معين، أي مجهر مقلوب مع هدف التكبير كافية لرؤية بنية دون الخلية في السؤال وكاميرا المرفقة التي لديها دقة كافية ومعدل التقاط الصور يجب أن تعمل.
في حين أن مختبرنا مهتم في المقام الأول بوظيفة الميتوكوندريا ، يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة في فحص ديناميكيات وتوطين أي بنية تحت الخلايا أو أعضاءية ، مثل النواة أو الهيكل الخلوي أو النتقال endoplasmic. ومع ذلك، هذا الأسلوب له قيود. من أجل إضافة بيروكسيد الهيدروجين، يجب أن يكون النسيج في وسائل الإعلام مائي. طريقة بديلة للتصوير الحي هو استخدام زيت الهالوكربون، الذي كان له دور فعال في وصف العديد من العمليات الهامة في ovarioles دروسوفيلا بما في ذلك أول مثال على الحركة الديناميكية من GFP في كائن حي نموذجي7،14. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى وسائل الإعلام يسبب الضرر التأ المؤكد واسعة الانتشار التي قد تكون عامة جدا إهانة للأنسجة لتكون مفيدة لعملية الخلوية من الفائدة، وخاصة بالنسبة للتجارب أطول دراسة التنمية. على الرغم من أنه قد لا يكون من الممكن تنفيذ التجارب التي تتطلب تصور الخلية على مدى فترات طويلة من الزمن بسبب هذا الضرر التأكسي السريع والواسع النطاق والمرجح، فقد رأينا أن علاج بيروكسيد الهيدروجين الحاد الذي وصفناه ينطبق على معظم مراحل تولد الخلايا حيث أننا قادرون على رؤية نفس الآثار في معظم المراحل خلال الفترة الزمنية للتصوير. ونظرا لانخفاض تكلفة وسهولة البروتوكول، قد يكون من المفيد السيطرة على الضرر ويمكن استخدامها كعلاج قبل التثبيت ووضع العلامات المضادة كذلك.
في أيدينا، H2O2 العلاج يحاكي التغيرات في سوء تخصيص الميتوكوندريا وتشتت الجسيمات كل النعيم التي نراها في المسوخ الدوزوفيليا المختلفة. كما أنه يحاكي النتائج التي نراها للباحثين الجدد في تقنيات تشريح التعلم المختبر. لذلك، كشفت هذه الطريقة بوضوح أن إعداد العينة والإجهاد الخلوي العام يمكن أن يؤدي إلى تغييرات غير متوقعة وغير مبررة سابقا لسوء تحديد المواقع الميتوكوندريا ووجود جزيئات النعيم. تحريك هذه التقنية إلى الأمام، يمكن تحوير تركيزات بيروكسيد الهيدروجين باستخدام تركيز أعلى أو أقل. إذا كان تأثير الخلوية هو أن ينظر باستخدام تركيز أقل, فمن الممكن أن يكون النمط الظاهري الإجهاد يمكن عكسها عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع شنايدر كاملة. قد تكون الضغوطات المختلفة للخلايا مثل الكربونيل سيانيد m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) أو الزرنينيت أو صدمة حرارية بسيطة مفيدة للإجهاد الخلوي العام للهياكل الأخرى دون الخلوية. منذ التصوير الحي للأنسجة الحية السابق يتطلب التلاعب اليدوي والحضانة في وسائل الإعلام المختلفة، وينبغي أن يكون هذا التحكم إضافة مفيدة لضمان أي ملاحظات هي أقرب إلى علم وظائف الأعضاء العادي ممكن.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور جيريمي سميث لدعم التصوير وآن سي شينك على الرسوم التوضيحية والإنتاج والفيديو. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1R01GM127938 إلى R.T.C.
Materials
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
