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Neuroscience

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Published: May 26, 2021
doi:
10.3791/62155
, ,
1Department of Human Genetics,University of Utah

Summary

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Abstract

La función del sistema visual requiere el establecimiento de estructuras precisas de tejidos y órganos. En el ojo de los vertebrados, los defectos estructurales son una causa común de discapacidad visual, sin embargo, los mecanismos de la morfogénesis ocular aún no se conocen bien. La organización básica del ojo embrionario se conserva en todos los vertebrados, por lo que las imágenes en vivo de embriones de pez cebra se han convertido en un enfoque poderoso para observar directamente el desarrollo del ojo en tiempo real en condiciones normales y patológicas. Los procesos celulares dinámicos que incluyen movimientos, morfologías, interacciones, división y muerte se pueden visualizar en el embrión. Hemos desarrollado métodos para el etiquetado uniforme de estructuras subcelulares y microscopía confocal timelapse del desarrollo ocular temprano en peces cebra. Este protocolo describe el método para generar ARNm tapado para inyección en el embrión de pez cebra de 1 célula, montar embriones en la etapa de vesícula óptica (~ 12 horas después de la fertilización, hpf) y realizar imágenes de lapso de tiempo multidimensional de la morfogénesis de la copa óptica en un microscopio confocal de escaneo láser, de modo que se adquieran múltiples conjuntos de datos secuencialmente en la misma sesión de imágenes. Tal enfoque produce datos que se pueden usar para una variedad de propósitos, incluido el seguimiento celular, las mediciones de volumen, la representación tridimensional (3D) y la visualización. Nuestros enfoques nos permiten identificar los mecanismos celulares y moleculares que impulsan el desarrollo de la copa óptica, tanto en condiciones de tipo salvaje como de mutantes genéticos. Estos métodos pueden ser empleados directamente por otros grupos o adaptados para visualizar muchos aspectos adicionales del desarrollo del ojo de pez cebra.

Introduction

El desarrollo del ojo de los vertebrados comienza con la aparición, o evaginación, de las vesículas ópticas del neuroepilio cerebral prospectivo. Las vesículas ópticas luego sufren una serie de cambios de forma del tejido, alargando y luego invaginando para generar la copa óptica. En la copa óptica, la retina neural y el epitelio pigmentario de la retina, ambos derivados del neuroepitelio, envuelven el cristalino naciente, que se deriva del ectodermo superficial. Todo el proceso requiere una serie compleja de movimientos celulares y tisulares y señalización molecular, coordinada entre las poblaciones de células neuroepitémicas, ectodermo y mesenquimales. Estos eventos iniciales establecen la estructura básica del ojo, y los pasos posteriores del desarrollo del ojo, incluida la formación del iris y la córnea, son elaboraciones sobre la organización temprana. Las interrupciones en el desarrollo temprano del ojo y la morfogénesis subyacen a numerosas condiciones de discapacidad visual en los seres humanos, incluyendo anoftalmía, microftalmia y coloboma. Desbloquear los mecanismos celulares y moleculares que gobiernan la morfogénesis de la copa óptica es crucial para comprender mejor el desarrollo del sistema visual y las condiciones patológicas que resultan cuando estos procesos salen mal.

Nuestra comprensión del desarrollo del ojo de los vertebrados y la morfogénesis surgió de una enorme cantidad de trabajo que abarca estudios histológicos clásicos hasta enfoques embriológicos y genéticos en una variedad de organismos modelo, incluidos ratones, pollitos, ranas y peces1,2,3,4,5. Si bien este cuerpo de trabajo estableció mecanismos moleculares que regulan el desarrollo temprano del ojo, históricamente existe una mala comprensión de la morfogénesis del ojo: la aparición de su estructura 3D. La mayor parte de estos hallazgos provienen de imágenes de embriones seccionados en puntos de tiempo discretos. Si bien esto es suficiente para proporcionar una visión de la morfología del tejido en 2 dimensiones, la morfogénesis es un proceso dinámico en 3D. Para determinar cómo cambia la forma del tejido en 3 dimensiones a lo largo del tiempo, cómo se comportan las células individuales y cómo esos comportamientos contribuyen a los cambios en la forma del tejido 3D, se deben diferentes enfoques.

Una solución para abordar esta brecha significativa en el conocimiento es la imagen en vivo, que permite la observación dinámica de células y tejidos en tiempo real a medida que el órgano toma forma. Desafortunadamente, esto no es fácilmente factible en muchos organismos modelo debido a las limitaciones del desarrollo embrionario. Por ejemplo, los embriones de ratón y pollito (que se desarrollan en el útero o dentro de una cáscara de huevo) no son de fácil acceso, y muchos embriones vivos no son ópticamente transparentes, lo que causa una dispersión significativa de la luz y limita la profundidad a la que se pueden adquirir las imágenes. El pez cebra, con desarrollo externo y embriones transparentes, brinda una oportunidad única para llevar a cabo imágenes en vivo de la morfogénesis ocular6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. También se dispone de amplias líneas transgénicas y mutantes, así como de herramientas para generar nuevos transgénicos y mutantes20,21,22,23,24. Además, la morfogénesis de la copa óptica ocurre rápidamente en el pez cebra, durante un período de tiempo de 12 h (12-24 horas después de la fertilización, hpf), lo que hace que las imágenes de todo el proceso sean factibles.

Los esfuerzos de imágenes en vivo se han acelerado por la expansión y optimización de la familia de proteínas fluorescentes, que permiten el etiquetado vital codificado genéticamente de las estructuras subcelulares, así como las mejoras e innovaciones en los métodos de microscopía. El protocolo descrito aquí utiliza microscopía confocal de barrido láser, en lugar de otros enfoques actuales para obtener imágenes de la embriogénesis del pez cebra, incluida la microscopía confocal de disco giratorio, la microscopía de iluminación de plano selectivo (SPIM y sus variantes) y otros métodos de microscopía más especializados. Para el ojo de pez cebra en desarrollo, encontramos que la microscopía confocal de disco giratorio no era suficiente para obtener imágenes más profundas en el tejido. Aunque SPIM cuenta con un tiempo de imagen extremadamente rápido y se está utilizando cada vez más, el manejo de los grandes conjuntos de datos para la visualización y el análisis sigue siendo un desafío. Por el contrario, la microscopía confocal de barrido láser es fácilmente accesible, especialmente para las personas que carecen de experiencia en el ensamblaje de hardware óptico. Esperamos que la amplia disponibilidad de microscopía confocal de barrido láser haga que nuestro protocolo sea útil para muchos laboratorios.

Aquí, describimos nuestro método para capturar conjuntos de datos 4D de morfogénesis de la copa óptica, utilizando en toto el etiquetado del embrión para membranas y cromatina, y un microscopio confocal de escaneo láser para la adquisición de imágenes (esquematizado en la Figura 1). Las proteínas fluorescentes utilizadas aquí (EGFP-CAAX y H2A. F/Z-mCherry) fueron elegidos para proporcionar un etiquetado tisular con resolución de una sola célula. Utilizamos conjuntos de datos generados con este protocolo para una variedad de funciones de análisis y visualización de imágenes. Este protocolo se puede adaptar fácilmente si se desean otras estructuras subcelulares. Se seleccionó el etiquetado de la membrana plasmática para la visualización de la forma celular: utilizamos EGFP-CAAX, en el que los últimos 21 aminoácidos de H-ras, que sirven como secuencia de señal de prenilación, se fusionan con el extremo C de EGFP13. Es probable que otras proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana plasmática (por ejemplo, fusión transmembrana o miristoiladas) funcionen igual de bien. Para marcar núcleos, seleccionamos H2A. F/Z-mCherry, en el que mCherry se fusiona con una proteína histona13. Esto asegura que la división celular, incluida la orientación del huso mitótico, se visualice fácilmente.

Con cualquier enfoque de imágenes en vivo, uno debe considerar las compensaciones entre aumentar la velocidad de la imagen y maximizar la relación señal-ruido, la resolución axial y la preservación de la muestra. Hemos optimizado nuestros métodos para maximizar la calidad de imagen y el número de embriones que se pueden obtener en una sola ejecución. A menudo, el objetivo es obtener imágenes de la morfogénesis de la copa óptica en un embrión mutante homocigoto, que puede ser fenotípicamente indistinguible del tipo salvaje al inicio de la morfogénesis de la copa óptica y la descendencia de un heterocigoto cruzado (el 25% de los embriones son el genotipo deseado). Al optimizar y luego multiplexar la adquisición de imágenes, existe una mayor probabilidad de capturar un conjunto de datos de un embrión mutante homocigoto.

La resolución temporal, o la frecuencia con la que se adquieren los datos de volumen (pilas Z), es un aspecto clave de las imágenes de lapso de tiempo. Dependiendo del propósito de dichos conjuntos de datos, existen diferentes requisitos de velocidad. Inicialmente, este protocolo se desarrolló para el seguimiento manual de células 4D. El seguimiento de células individuales dentro de un tejido etiquetado uniformemente requiere una resolución temporal lo suficientemente alta como para proporcionar confianza en que cualquier célula está siendo rastreada continuamente a lo largo del tiempo. Encontramos que las pilas Z de morfogénesis de la copa óptica del pez cebra deben adquirirse al menos cada 3,1 min durante 12 h; aquí, hemos optimizado nuestra adquisición en un microscopio confocal de barrido láser de tal manera que podemos adquirir pilas Z de 4-5 embriones cada 2,5 min.

Establecer el tamaño del paso Z fue un paso crucial en la optimización del protocolo: para la representación y visualización 3D, los datos isotrópicos son ideales, en los que el tamaño del paso Z es igual a la dimensión de píxel XY. En realidad, es extremadamente difícil adquirir tales datos de lapso de tiempo con muestras en vivo, dadas las limitaciones con el tiempo de obtención de imágenes y el fotobleaching. Por lo tanto, determinar el tamaño adecuado del paso Z es importante para las necesidades de renderizado y visualización del experimento, y específicamente, qué relación de vóxel X: Y: Z se necesita para maximizar la información axial mientras se mantiene la velocidad y se evita el fotobleaching. Para este protocolo, la relación de vóxel establecida fue de 1:1:3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm de tamaño Z-step utilizando un objetivo de inmersión en agua de larga distancia de trabajo de 40x). Al adquirir una profundidad Z de 130-140 μm, esto produce datos de volumen con una resolución temporal adecuada y poco fotobleaching.

Como se discutió anteriormente, este protocolo es específico para imágenes 4D de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra, utilizando embriones en toto marcados para membrana plasmática y cromatina, y un microscopio confocal de barrido láser. El siguiente protocolo se puede adaptar fácilmente para una variedad de experimentos y necesidades. Primero, con respecto a las estructuras subcelulares, se puede obtener una imagen de cualquier estructura para la cual exista un marcador de células vivas. A continuación, aunque el enfoque aquí es exclusivamente en la morfogénesis de la copa óptica, las imágenes de lapso de tiempo se pueden adaptar para otras etapas del desarrollo ocular, por ejemplo, neurogénesis25,26, 27,28, 29,30,31,32,33. Para el desarrollo posterior de imágenes, es posible que deba considerar la inmovilización del embrión (ya que la actividad muscular espontánea comienza alrededor de 24 hpf), la pigmentación (que comienza a emerger alrededor de 24 hpf), el tamaño del tejido (el ojo crece significativamente en volumen durante la neurogénesis) y la velocidad de la imagen (que debe ajustarse según la velocidad del proceso de interés). Todas estas consideraciones se pueden manejar fácilmente. El protocolo es bastante flexible; además de los detalles del protocolo específico aquí, hay principios generales que ayudarán a aquellos interesados en imágenes en vivo otros aspectos del desarrollo ocular.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí utilizando el pez cebra están cubiertos por el protocolo animal de la Dra. Kristen Kwan, “Mecanismos celulares y moleculares del desarrollo del sistema visual en el pez cebra”, y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah. 1. Síntesis de ARN tapado Generar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro. Linealizar la plantilla de ADN digiriendo 10 μg de ADN en un volumen de 100 μL de la mezcla de reacción. Una reacción típica se ensambla de la siguiente manera: digerir 10 μg de ADN usando 3 μL de enzima y 10 μL de tampón, llevar el volumen de reacción a 100 μL con agua.NOTA: Una plantilla típica para el resumen es un vector pCS2, por ejemplo, pCS2-EGFP-CAAX o pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry para el etiquetado de membrana y cromatina descrito aquí. En este caso, los ADN plásmidos se digieren utilizando la enzima NotI. Los usuarios deben tener cuidado con la actividad estelar; en este caso, se recomienda una enzima de alta fidelidad y está disponible comercialmente. Incubar la reacción a 37 °C durante la noche para asegurar que el ADN se digiera hasta su finalización. Limpie el resumen de restricción utilizando un kit de purificación de PCR siguiendo el protocolo del fabricante. Eluya el ADN con 30 μL ddH2O. Almacene el ADN linealizado a -20 °C y úselo según sea necesario.NOTA: La cantidad de ADN digerido y el volumen de elución producen aproximadamente 0,3 μg/μL; esto es suficiente para ~ 5 rondas de transcripción in vitro, cada ronda usando ~ 2 μg de ADN como plantilla. Transcribir IN vitro el ARN tapado utilizando un kit de transcripción in vitro. Para las plantillas pCS2 (como se describe aquí), utilice un kit SP6. Ensamble la reacción de transcripción in vitro, de la siguiente manera: Digiera 2 μg de plantilla de ADN o hasta 6 μL con 2 μL de 10x Reaction Buffer, 10 μL de 2x Ribonucleotide Mix y 2 μL de 10x Enzyme Mix. Incubar a 37 °C durante 2-4 h o más (tiempos más largos conducirán a un mayor rendimiento). Si se desea, se puede complementar 1 μL de enzyme Mix a mitad del período de incubación. Digiera la plantilla de ADN agregando 1 μL de DNasa libre de RNasa e incubando durante 15 min a 37 °C. Purifique el ARN tapado utilizando un kit de purificación de ARN siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Elute con 100 μL de H2O libre de RNasa.NOTA: La adición de β-mercaptoetanol no es necesaria para esta aplicación. Si bien el método descrito en este protocolo es sencillo, también se pueden usar reactivos alternativos para purificar el ARN. Precipitar el ARN. Agregue 10 μL de NaOAc libre de RNasa de 3 M y 2,5 volúmenes (~275 μL) de EtOH 100% libre de RNasa helada al ARN eluido. Incubar la reacción a -20 °C durante 15-30 min. Girar durante 15 min a alta velocidad a 4 °C para peletizar el ARN.NOTA: El pellet debe ser visible contra la pared del tubo. Es útil observar cómo se alinea el tubo en la centrífuga en este paso, para predecir dónde debe estar el pellet al final del giro. Retire el EtOH cuidadosamente con una jeringa, teniendo cuidado de evitar calentar, secar en exceso o desalojar el pellet. Resuspend el pellet en 20 μL de H2O libre de RNasa. Compruebe el ARN para asegurarse de que la síntesis es exitosa. Use 1 μL para analizar la concentración en un espectrofotómetro y ejecute 0.5 μL en un gel de agarosa al 1% para verificar si hay una o dos bandas discretas, en lugar de un frotis de bajo peso molecular. El rendimiento de la reacción de transcripción in vitro debe ser de ~1 μg/μL. Alícuota y almacene el ARN a -20 °C o -80 °C. El ARN no se diluye hasta inmediatamente antes de las inyecciones. 2. Microinyección de embriones de pez cebra de 1 célula NOTA: Inyectar 200-300 pg por ARN para obtener la expresión ubicua de cromatina y membranas celulares a lo largo de la morfogénesis de la copa óptica. Preparar 5-10 μL de la dilución de ARN, y cargar 2.5-5 μL/aguja; planifique un extra en caso de que la aguja se rompa. Preparaciones anticipadas para inyecciones. Prepare un plato de molde de inyección para facilitar la alineación y orientación de los embriones de 1 célula para la microinyección. Derretir el 2% de agarosa en E3 (medio embrionario estándar) y verter en una placa de Petri. Flote cuidadosamente el molde de inyección (ver Tabla de Materiales)en la parte superior de la agarosa caliente para generar la huella de los canales en la agarosa a medida que se solidifica. Una vez que la agarosa se solidifique, retire el molde de inyección.NOTA: Los platos de molde de inyección se pueden usar durante varios meses; cubrir en E3 y conservar a 4 °C cuando no esté en uso. Tire de las agujas de microinyección. Tire de los capilares de vidrio a un cónico largo para hacer agujas de microinyección usando una máquina de extracción de agujas. Programe la máquina específica para el tipo de capilares utilizados. Para capilares de borosilicato de 1,0 x 0,78 mm utilice el siguiente programa: calor = 546 °C, tracción = 130, velocidad = 70, tiempo = 90 (Figura 2F). Guarde las agujas en una placa de Petri y asegúrela con arcilla de modelado.NOTA: La receta de extracción variará, dependiendo de la máquina y el filamento, y los filamentos nuevos siempre deben calibrarse. Cada ronda de tracción produce dos agujas(Figura 2G); haga esto varias veces para producir suficientes agujas en caso de roturas accidentales y experimentos futuros. Diluya el ARN tapado para inyección. Diluir tanto los ARN EGFP-CAAX como los H2A-mCherry a una concentración de 200-300 ng/μL utilizando H2O libre de RNasa y 1 μL de rojo fenol en un volumen total de 5 μL (la concentración final de rojo fenol es del 0,1%). Mueva la mezcla y gire brevemente hacia abajo para recoger el volumen total. Mantenga el ARN diluido en hielo antes de inyectarlo. Inyección de embriones de 1 célula Una vez que los peces comiencen a reproducirse, permita ~ 15-20 minutos para asegurarse de que los huevos se fertilizen. Durante este tiempo, cargue la aguja con 2.5-5 μL de la dilución de ARN utilizando puntas de microcargador P10 y P10. Usando un picoinyector, calibre la aguja usando una retícula ocular (una diapositiva de calibración micrométrica también es suficiente) para medir el volumen de la gota (volumen de una esfera = (4/3) * pi * radio ^ 3). Ajuste el tiempo y la presión de inyección de tal manera que el volumen de inyección sea de 1 nL (Figura 2I). Con una pipeta de rodillo/transferencia, cargue cuidadosamente los huevos en el molde de inyección (Figura 2J). Si es útil, use forrceps para enrollar embriones de tal manera que la célula única sea visible, ya sea antes o durante la inyección. Es preferencia del usuario utilizar un micromanipulador. Inyectar embriones en la etapa de 1 célula, dirigiéndose a la célula y no a la yema (Figura 2M). Esto garantizará un etiquetado uniforme del embrión en desarrollo. Elevar los embriones a la etapa deseada (antes de 12 hpf, de acuerdo con la estadificación estándar34). Los embriones inyectados tendrán un desarrollo retrasado, así que levántalos a una temperatura ligeramente más alta (29.0-29.5 °C) para compensar el tiempo. Durante la tarde, revisa los embriones y retira los que están muertos para preservar la salud del embrague. 3. Montaje de embriones de pez cebra en etapa de vesícula óptica para imágenes de lapso de tiempo Antes de montar, prepare agarosa de baja fusión al 1,6% en E3. Si planea múltiples experimentos de imágenes, prepare ~ 20 ml de agarosa de baja fusión y guárdelo a temperatura ambiente. El día del montaje del embrión, derrita esto para generar una alícuota fresca (1-5 ml) en un tubo que se puede colocar en un bloque de calor de 42 ° C antes del montaje. Examinar los embriones para una inyección exitosa y el brillo general de la fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia antes del montaje. Una muestra ideal tendrá una fuerte fluorescencia EGFP y mCherry y estará en la etapa de desarrollo correcta(Figura 3B – B”). Examinar embriones con un microscopio de fluorescencia. Seleccione embriones que expresen fuertemente la fluorescencia EGFP y mCherry para su montaje. Seleccione embriones que sean 11 hpf. Contar somitas para estadificar adecuadamente los embriones34; a 11 hpf debe haber 3 somitas, y por 12 hpf hay 6 somitas.NOTA: Al montar embriones antes de 12 hpf (a 11 hpf), las muestras se escenificarán adecuadamente a 12 hpf cuando comience el timelapse. Descoronar embriones antes del montaje. Haga esto manualmente con fórceps finos o químicamente usando pronasa (2 mg / ml). Con embriones tan jóvenes, es esencial que la decorolinación se realice dentro de un plato recubierto de agar y que los embriones no entren en contacto con la interfaz aire-agua. Usando una pipeta de rodillo de vidrio, succione un embrión y expulse la mayor cantidad posible de E3 de modo que el embrión se asiente en la punta de la pipeta pasteur de vidrio. Deje caer el embrión en el tubo de agarosa del bloque de calor. Deje que se hunda en la agarosa durante unos segundos, luego succione un poco de agarosa primero y luego el embrión, asegurándose de que el embrión permanezca en la punta de la pipeta (Figura 3C – C ‘). Coloque un plato con fondo de vidrio para obtener imágenes debajo de un endoscopio de disección. Expulse el embrión y la agarosa en una gota de agarosa en el plato con fondo de vidrio. Use fórceps para orientarse muy rápidamente, de modo que el embrión esté dorsal hacia abajo (parte superior de la cabeza en la parte inferior de vidrio). Deje que la gota de agarosa se endurezca (Figura 3D – D ‘). Este paso debe hacerse de manera rápida pero cuidadosa, ya que los embriones en esta etapa son frágiles. Los embriones dañados no sobrevivirán al proceso de imágenes de lapso de tiempo.NOTA: Es importante orientar todos los embriones de manera consistente para este experimento. Al realizar el timelapse, los embriones deben encajar dentro del campo de visión asignado mientras se mantiene un espacio adicional para que crezca la vesícula óptica. Una orientación óptima es alinear el eje anterior-posterior de todos los embriones “verticalmente” o a lo largo de las 12 y 6 en punto en una esfera de reloj(Figura 3G). Montar entre 10-12 embriones, que es más del doble de los que se tomarán imágenes, de modo que se puedan seleccionar las mejores muestras una vez evaluadas en el confocal (Figura 3E – E ‘). Las muestras se evaluarán por edad, uniformidad del etiquetado fluorescente y precisión de la orientación de montaje. Después de montar los embriones, pipetee más agarosa para cubrir completamente la parte inferior del plato, envolviendo así todas las gotas de agarosa separadas en un solo disco de agarosa grande (Figura 3F – F ‘). Una cantidad suficiente de agarosa asegurará que las gotitas embrionarias individuales o todo el disco no se levanten del fondo del plato y floten fuera de la vista. Una vez endurecido, superponga la agarosa con E3 para mantener las muestras hidratadas durante la duración del experimento de imágenes de lapso de tiempo (una preocupación dependiendo de la humedad del edificio y del ambiente).NOTA: La tricaína no es necesaria para estos experimentos específicos de imágenes de lapso de tiempo, ya que estos embriones son lo suficientemente jóvenes; sin embargo, si se desea, y si se trabaja con etapas más antiguas de embriones, se puede agregar tricaína a la propia agarosa y superponerse en los medios. En papel, dibuje un mapa de los embriones para una fácil referencia durante la configuración del lapso de tiempo. Esto es crucial para posteriormente asociar la posición con el genotipo de cada muestra. 4. Timelapse confocal de posición múltiple con un microscopio confocal de barrido láser NOTA: Este protocolo de imágenes timelapse fue diseñado para ser utilizado con un microscopio confocal de barrido láser equipado con el software del fabricante (ver Tabla de Materiales). Este sistema está equipado con un dispositivo piezoeléctrico de etapa Z que permite la adquisición rápida de pilas Z. Las líneas láser utilizadas en este protocolo son un láser de iones de argón de 488 nm y un láser DPSS de 561 nm. El láser de 561 nm es adecuado para obtener imágenes del fluoróforo mCherry: está lo suficientemente cerca del pico de excitación mCherry (587 nm) y bien alimentado. Configure el confocal. Encienda el confocal e inicie sesión en la computadora de escritorio. Instale el inserto piezoeléctrico de la etapa Z(Figura 4B) y, acontinuación, inicie el software de adquisición. En el software dentro del modo Adquisición, encienda los láseres 488 y 561 utilizando el menú desplegable(Figura 4F). Los láseres tardan varios minutos en calentarse, por lo que este paso se realiza temprano para ahorrar tiempo.NOTA: Los parámetros de adquisición son los siguientes: Marque las casillas Pila Z, Serietemporal y Posición. Establezca el tamaño del fotograma en 512 (X) x 384 (Y), la velocidad de escaneo en 9, el modo de escaneo en bidireccional, el zoom en 0,7, el agujero de alfiler en 60,2 (1,63 unidades aireadas ~= sección de 1,6 μm) y el intervalo Z en 2,1 μm. Esto producirá un tamaño de imagen de 303.6 μm x 227.7 μm y un tamaño de píxel de 0.59 μm. Los láseres 488 y 561 deben ser revisados y asignados a la misma pista; el rango de detección EGFP es de 494-545 nm y el rango de detección de mCherry es de 598-679(Figura 4F). Cubra generosamente el fondo de la placa de vidrio con un medio de inmersión que coincida con el índice de refracción del agua, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire(Figura 4C). Seleccione el objetivo de agua 40x y aplique una pequeña gota de medio de inmersión al objetivo (Figura 4D). Asegure el plato con fondo de vidrio en el inserto de la etapa, aplique E3 para mantener los embriones húmedos durante la noche, luego use arcilla de modelado para sellar la tapa de plástico sobre el plato (Figura 4E). Elevar el objetivo para hacer contacto con el plato. Muestras de pantalla y prepárate para el timelapse. Cambie de la pestaña Adquisición a la pestaña Localizar y haga clic en el símbolo de la bombilla para encender la luz transmitida. Con la luz transmitida, localice la primera muestra con el joystick: a ojo, primero mueva la muestra hacia el haz de luz, luego use los oculares hacia el centro y enfoque en una vesícula óptica. Vuelva a la pestaña Adquisición. Asegúrese de que las casillas Pila Z, Serie temporaly Posiciones estén marcadas y que los láseres se calienten para su uso. Establezca el tamaño del fotograma en 512 (X) x 384 (Y), la velocidad de escaneo en 9, el modo de escaneo en bidireccional y establezca zoom en 0,7. En el encabezado Canales, comience asignando los láseres 488 y 561 a Power 2.0 y Gain 550 (esto se puede ajustar más adelante). Establezca el agujero de alfiler en 60.2 (1.63 unidades aireadas ~= sección de 1.6 μm). Comience a escanear con el botón Continuo. Con la perilla de enfoque fino, ubique la muestra en el eje Z y coloque el eje X-Y en el marco. Detenga el escaneo. En el encabezado Posiciones, haga clic en Agregar para guardar la información XYZ de la primera muestra(Figura 4F). Haga esto solo para que las muestras se queduren en el tiempo. Seleccione muestras por su fuerte fluorescencia y montaje óptimo. Cambie a la pestaña Localizar, vaya a la siguiente muestra y repita los pasos 4.2.5-4.2.6, siendo selectivo a la hora de elegir muestras. Finalice las posiciones de muestra, asigne el rango z y, a continuación, inicie el lapso de tiempo. Una vez que se seleccionan todas las muestras (es posible obtener imágenes de 4-5 muestras dentro del intervalo de tiempo total de 2,5 minutos) y se guardan las posiciones, revise cada muestra y ajuste la posición XYZ dentro del marco de visualización. Resalte la primera posición y haga clic en Mover a. Mientras escanea continuamente, alinee la vesícula óptica dentro del marco. Deje un amplio espacio en las regiones anterior y distal en relación con la vesícula óptica y el cerebro. A continuación, asigne la primera y la última división Z seleccionando Establecer primero y Establecer último mientras se mueve a través de la dirección Z con la perilla de enfoque fino. Mantenga un número total de rebanadas de ~ 63, ya que esto se adaptará al crecimiento de la copa óptica. Proporcione espacio adicional en el lado ventral de la vesícula óptica para permitir espacio para el crecimiento. Una vez que se hayan configurado la primera y la última división Z, haga clic en el botón C para moverse al centro de la pila Z. Ajuste la potencia y la ganancia del láser para ambos láseres; si es posible, mantenga la potencia del láser por debajo de 5 y use una ganancia más alta, si es necesario. Detener el escaneo. Actualice la información de posición haciendo clic en Actualizar. Vaya a la siguiente posición haciendo clic en Posición 2. Repita los pasos 4.3.1-4.3.3 para cada posición asignada. La potencia y la ganancia del láser deben establecerse de tal manera que todas las muestras estén suficientemente iluminadas. Una vez que se haya finalizado tanto la información de posición como la configuración del láser, asigne la configuración de la serie temporal. En el encabezado Serie de tiempo, asigne Intervalo de tiempo a 2,5 min y Ciclos a 300(Figura 4F). El número de ciclos se calcula de tal manera que el lapso de tiempo pasa más allá de la etapa de 24 hpf, cuando se completa el desarrollo de la copa óptica. Para comenzar el timelapse, haga clic en Inicio. Supervise el primer ciclo completo: use un temporizador para asegurarse de que un ciclo completo (obtención de imágenes de todas las posiciones) sea inferior a 2,5 minutos y verifique que cada posición se vea correcta. El microscopio funciona de forma independiente durante la noche y no necesita ser monitoreado.NOTA: Aunque la habitación confocal tiene temperatura controlada, la temperatura ambiente es de 20-25 °C. Con el equipo en funcionamiento y el escaneo con láser, la temperatura en el escenario parece estar más cerca de 28.5 ° C, ya que el desarrollo embrionario avanza a este ritmo esperado, según lo ensayado visualmente con puntos de referencia morfológicos. Con estos ajustes, el timelapse durará 12,5 h. Guarde el archivo una vez que se haya completado el lapso de tiempo. Será grande (~ 40 GB) y se puede separar en posiciones individuales después de que se guarde utilizando el software de adquisición.

Representative Results

La inyección de ARN fluorescentes permite el etiquetado subcelularLos ARN que marcan la membrana plasmática de la célula y las histonas se inyectan para capturar las morfologías y movimientos celulares individuales que subyacen a la morfogénesis de la copa óptica. La Figura 2 muestra cada paso del proceso de microinyección de embriones de pez cebra en la etapa de 1 célula. Brevemente, el pez cebra se aparea(Figura 2E),y los embriones se recogen y se cargan en el molde de inyección(Figura 2J). Se rellena una aguja de microinyección(Figura 2H),y los embriones se inyectan directamente en la célula única(Figura 2K-M),lo cual es necesario para obtener un etiquetado uniforme(Figura 2M, Figura 4I-I”’,Película1). Además del etiquetado uniforme, se observa una fluorescencia robusta y el desarrollo avanza sin perturbaciones (Figura 3B-B”). El montaje efectivo es esencial para el OCM de imágenes de lapso de tiempo de 12a24 hpfPara obtener imágenes de la morfogénesis de la copa óptica, que ocurre durante un período prolongado de tiempo, es fundamental seleccionar embriones ideales y posicionar adecuadamente cada muestra mientras se incrusta. La Figura 3 muestra una descripción detallada para el montaje exitoso de embriones de 11 hpf. Los embriones inyectados se examinan primero para detectar suficiente fluorescencia(Figura 3B’,B”, F”, F”’). Los embriones individuales se sumergen en agarosa (Figura 3C, C ‘)y se montan dorsalmente en una gota individual de agarosa (Figura 3D, D ‘). Todas las muestras están montadas en un disco colectivo de agarosa (Figura 3E-F’). Cuando los embriones están estadificadas correctamente, suficientemente fluorescentes y montadas adecuadamente(Figura 3G),las muestras permanecerán en el marco de la imagen durante el lapso de tiempo, lo que permitirá obtener imágenes de todo el órgano(Figura 4G-G”,I-I”’,Película1). Si no se realiza ninguno de estos pasos, se producirá un embrión montado que no es una muestra óptima para las imágenes de lapso de tiempo. La más mínima variación en el grado de rotación tendrá un efecto dramático en la dirección del crecimiento embrionario durante el lapso de tiempo. Las rotaciones subóptimas se muestran en la Figura 3,incluyendo un embrión que está sobre-rotado (Figura 3I), lo que dará como resultado un timelapse más posterior, y un embrión que está sub-rotado (Figura 3J) en el que sólo se puede observar el tejido más anterior. Además de la rotación adecuada durante el montaje, las muestras que se montan con respecto a la orientación del marco tienen más probabilidades de producir un lapso de tiempo exitoso(Figura 4G-G”,I-I”’,Película1). Las muestras óptimas son aquellas que están orientadas verticalmente sobre el plato, con el eje anterior-posterior en línea con las 12 y las 6 en punto en una esfera de reloj(Figura 3G). Las muestras subóptimas son aquellas que no están orientadas sobre este eje, como las que son horizontales o diagonales (Figura 3H). Estas muestras crecerán fuera del marco de la imagen a medida que avance el lapso de tiempo y no se pueden usar para análisis adicionales(Figura 4H-H”,J-J”’). Adquisición de un conjunto de datos de lapso de tiempo que sea adecuado para análisis futurosLos embriones que se inyectan, elevan y montan con precisión darán lugar a muestras con imágenes confocales exitosas. La Figura 4 muestra una muestra óptima para el timelapse: incluso hay fluorescencia y la muestra es de 12 hpf. La pila z para la obtención de imágenes se asigna de tal manera que la primera rebanada es solo dorsal a la vesícula óptica, mientras que la última rebanada deja varias rodajas más allá del límite ventral de la vesícula óptica de 12 hpf(Figura 4G-G”). Este sesgo hacia el lado ventral proporciona un exceso de espacio para el crecimiento del tejido en la dirección ventral. Estos factores, cuando se cumplen, dan como resultado un timelapse óptimo(Figura 4I-I”’,Película1). Una muestra subóptima tiene fluorescencia de mosaico o tenue, ya ha desarrollado más de 12 hpf (cuando la morfogénesis de la copa óptica está en curso), o está mal posicionada en la pila Z o el marco XY(Figura 4H-H”). Cuando no se cumplen estos criterios, el timelapse ya no capturará todo el volumen 3D del tejido a medida que se desarrolla y no se puede utilizar para análisis adicionales(Figura 4J-J”’). Figura 1: Flujo de trabajo de imágenes de lapso de tiempo 4D de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra. (A) Para etiquetar fluorescentemente las estructuras subcelulares de interés, sintetice los ARNm con tapa adecuada. (B) Microinyectar ARNm en embriones de pez cebra en la etapa de 1 célula. (C) Los embriones se montan dorsalmente, o de cabeza hacia abajo para un microscopio confocal invertido, en la etapa de vesícula óptica, ~ 11 h después de la fertilización o 3 etapas de somita. (D) Múltiples embriones pueden ser fotografiado secuencialmente durante una sola sesión de imágenes de lapso de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Una guía visual para microinyectar embriones de pez cebra de 1 célula. (A) Artículos para incluir en un kit de inyección (en el sentido de las agujas del reloj): caja de tamaño mediano que puede contener todo el kit con guantes de nitrilo desechables; un plato que contiene agujas de microinyección; forzas; una alícuota de aceite mineral y cuadrados cortados de parafilm; puntas de microcarga; ARN diluido en hielo; molde de inyección de agarosa; marcador; rodillo/pipeta de transferencia; y pipeta P10. (B) Configuración de microinyección: un microscopio de disección junto a un picoinyector que está conectado a una fuente externa de gas comprimido. Un pedal y un micromanipulador están conectados al picoinyor. El micromanipulador está equipado con un soporte de aguja y se coloca en su lugar por encima de la etapa del microscopio. (C) Un molde de inyección de agarosa que contiene seis filas de ranuras con un ángulo de 90 grados en un lado y un ángulo de 45 grados en el otro lado. (D) El panel frontal del picoinyor. La pantalla de presión lee 7.8 PSI; esto se puede ajustar con la perilla etiquetada comoinyecciónP. Debajo, hay pulsadores para activar manualmente la presión para inyectar, para cambiar el tiempo de inyección o para limpiar, llenar o mantener el líquido en la aguja. El tiempo de inyección se establece en 08 (equivalente a 8 x 10 mseg). Una manguera de salida está conectada a lasalida P y se conecta a la aguja de inyección. El interruptor de la fuente del medidor de presión se ajusta a lainyección P mientras se establece la presión de inyección, y se puede cambiar a labalanza P para ajustar la presión basal aplicada a la aguja cuando no se realizan las inyecciones. El reguladorde equilibrio P está al lado del reguladorde inyección P. El botón de encendido está encendido para indicar que la máquina está encendida. (E)El pez cebra adulto se aparea en pequeños tanques de cría que contienen un tanque anidado con un fondo de malla que separa a los peces adultos de los huevos fertilizados y permite una fácil recolección. El nivel del agua se reduce para imitar las condiciones de aguas poco profundas y los divisores del tanque se eliminan para iniciar el comportamiento de apareamiento. (F) El panel frontal del tirón de micropipeta (aguja): contiene una pantalla que muestra las condiciones específicas utilizadas para tirar de las agujas. El ajuste de presión es P = 500, seguido de la última fecha y hora en que se editó el programa, el número de programa, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 y TIME = 90. (G) Se inserta un capilar de vidrio en el tirón de micropipeta (aguja) y se fija en su lugar. Cada tirada programada da como resultado dos agujas largas y cónicas (puntas de flecha rojas). (H) La dilución de ARN se carga de nuevo en una aguja; el tinte rojo fenol permite una fácil visualización de la solución. (I) Después de romper la punta de la aguja, el bolo de ARN se mide utilizando una retícula ocular en el endoscopio de disección. Para este estereomitroscopio, a un aumento total de 30x, 6 marcas hash es igual a 1 volumen nL. (J) Los huevos fertilizados se cargan en el molde de inyección de agarosa y se distribuyen a lo largo de los canales del molde utilizando una pipeta de rodillo. (K) El molde de inyección que contiene embriones en etapa de una célula se coloca bajo el microscopio y los embriones se inyectan secuencialmente. (L) La aguja de inyección se inserta en cada embrión dirigido a la célula individual. (M) Una vez en la célula, el pedal se utiliza para desencadenar una cantidad regulada de presión y la liberación de 1 nL de ARN en la célula del embrión (como se visualiza por el rojo fenol). Barras de escala: I = 0,1 mm; L, M = 0.5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Guía visual para el montaje de embriones para la obtención de imágenes. (A) Configuración de montaje (de izquierda a derecha): un bloque de calor programado a 42 °C, tubos de calentamiento de agarosa de baja fusión; una pipeta de rodillo; un par de forrceps; un plato recubierto de agarosa que contiene embriones decoronados; y un estereomitroscopio de disección conectado a una lámpara fluorescente de halogenuros metálicos. (B,B’,B”) Un embrión de 11 hpf inyectado con ARNm EGFP-CAAX y ARNm mCherry-H2A, que se muestran bajo campo brillante, fluorescencia GFP y fluorescencia mCherry, respectivamente. (C,C’) Una pipeta pasteur de vidrio que contiene agarosa y un embrión sentado en la punta; C’ es una visión ampliada. (D,D’) Un embrión montado en una gota de agarosa de baja fusión en un plato con fondo de vidrio, visto tanto desde la etapa del microscopio como a través de los oculares del microscopio. (E,E’) 12 embriones montados en gotitas individuales de agarosa de baja fusión en un plato con fondo de vidrio, vistos tanto desde la etapa del microscopio como a través de los oculares del microscopio. (F,F’,F”,F”’) Todos los embriones montados se superponen con una capa completa de agarosa para llenar el fondo del plato, vista tanto desde la etapa del microscopio como desde los oculares del microscopio que se muestran en campo brillante; F” Fluorescencia GFP; y F”’ mCherry fluorescencia. (G) Una muestra óptima a 12 hpf se monta dorsalmente y se orienta verticalmente en línea con las 12 y las 6 en punto con ambas vesículas ópticas en el mismo plano. (H) Una muestra subóptima: aunque las vesículas dorsales y ópticas montadas están en plano entre sí, esta muestra está orientada en un eje diagonal y crecerá fuera del tamaño del marco a medida que avance el desarrollo. (I) Una muestra subóptima: esta muestra está sobre-rotada y no una montura dorsal, como resultado, la porción anterior de la vesícula óptica no se capturará en el timelapse. (J) Una muestra subóptima: esta muestra está sub-rotada y no una montura dorsal, como resultado la porción posterior de la vesícula óptica no será capturada en el timelapse. Las líneas punteadas indican cada vesícula óptica. Barras de escala: B = 0,1 mm; D’ = 1,5 mm; E’, F’ = 2,5 mm; G = 0.1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Configuración de un lapso de tiempo de posición múltiple y resultados potenciales. (Un) Microscopio confocal de barrido láser. (B) Inserto piezoeléctrico de etapa Z. (C) El fondo de un plato con fondo de vidrio que contiene embriones incrustados en agarosa está recubierto de medio de inmersión que coincide con el índice de refracción del agua. (D) Se coloca una gota de medio de inmersión en el objetivo de 40x W (larga distancia de trabajo). (E) El plato se mantiene en su lugar con el inserto del escenario, se agrega E3 sobre la capa de agarosa y la tapa se asegura con arcilla de modelado. (F) Configuración del software de adquisición: Las líneas láser deseadas se activan desde el menú desplegable. Para los embriones inyectados con ARN EGFP-CAAX y ARN H2A-mCherry, se encienden los láseres Argon y DPSS 561-10. El resaltado rojo indica que el láser de argón se está calentando. Para localizar la muestra sobre el objetivo, la luz transmitida se enciende a través del panel de control del microscopio. Tanto EGFP como mCherry se asignan a la pista 1 (para imágenes simultáneas) y se establece el rango de cada detector. Aquí, el rango EGFP se establece en 494-545 nm, y el rango mCherry se establece en 598-679 nm. Bajo el Canales menú, se puede configurar la potencia del láser. Después de que los láseres se hayan calentado, la potencia se puede aumentar hasta 5.0 y la ganancia (maestro) se puede ajustar. El agujero de alfiler se establece en 60.2, que es igual a 1.63 Unidades Aireadas o 1.6 μm de sección. Bajo el Adquisición , el tamaño del fotograma se establece en 512 x 384, la velocidad de escaneo es de 9,0, el promedio es bidireccional y el zoom se establece en 0,7. Bajo el Pila Z menu, la primera y la última posición en el eje Z se establecen mientras el confocal está escaneando. El intervalo (tamaño del paso) se establece en 2,1 μm. Al elegir la primera y la última posición Z, generalmente se mantiene un número estándar de 63 rebanadas; esto se adapta al crecimiento general del ojo. La opción “usar piezo” está seleccionada. Bajo el Posiciones , cada posición seleccionada se enumera incluyendo un número asignado y la posición X, Y y Z. Hay botones adicionales para controlar el número de embriones (posiciones separadas) para obtener imágenes, que incluyen agregar, actualizar o eliminar. Bajo el Series temporales , el ciclo se establece en 300 (el número de pilas Z que se adquirirán) y el intervalo (paso de tiempo) se establece en 2,5 min. Una vez finalizados los ajustes, se inicia la adquisición de timelapse pulsando start. El software mostrará la porción de la pila Z, el ciclo y la posición que se está escaneando actualmente. Cuando se completa el lapso de tiempo, el archivo se guarda haciendo clic en el icono del disquete en el Imágenes y documentos tablero. (G-J) Membranas celulares (green) están etiquetados con EGFP-CAAX y núcleos celulares (cromatina, magenta) están etiquetados con ARN H2A-mCherry. (G, G’, G”) Un ejemplo de configuración de la primera y última rebanada Z para una muestra montada de forma óptima. La primera rebanada Z (en el lado dorsal) viene a expensas del ectodermo dorsal, mientras que la última rebanada Z (en el lado ventral) está muy por debajo de la vesícula óptica, para acomodar su crecimiento en la dirección ventral. (H, H’, H ”) Un ejemplo de configuración de la primera y última rebanada Z de una muestra subóptima. La muestra tiene una fluorescencia mCherry débil y está montada en diagonal, de modo que es poco probable que la copa óptica en desarrollo permanezca en el marco durante la duración del lapso de tiempo. (Yo, yo, yo, yo, yo”) Un ejemplo de un timelapse a partir de una muestra óptima. Las imágenes de un solo segmento desde el centro de la pila Z se toman de todo el volumen de 63 segmentos en 4 puntos de tiempo (valor T). Br, cerebro; NR: retina neural; EPR: epitelio pigmentado de la retina; Le, lente. (J, J’, J”, J”’) Un ejemplo de un timelapse de una muestra subóptima. En este caso, la muestra se movió fuera del plano Z y solo se capturó una porción oblicua de la copa óptica anterior. Barras de escala: G, I = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Película 1: Timelapse de la morfogénesis de la copa óptica en un embrión óptimo de tipo salvaje. Vista dorsal de un embrión de tipo salvaje que está etiquetado con EGFP-CAAX (membranas plasmáticas, verde)y H2A. F/Z-mCherry (cromatina, magenta). El timelapse es de ~12-24 hpf y contiene una sola sección confocal de un conjunto de datos 4D completo. El intervalo de tiempo es de 2,5 min entre las pilas z y se muestra a 22,5 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para descargar esta película.

Discussion

Aquí, describimos un protocolo para el etiquetado in toto y la imagen de lapso de tiempo 4D de la morfogénesis de la copa óptica. Pasamos por el proceso de generación de ARN tapado que codifica proteínas fluorescentes para marcar diferentes compartimentos subcelulares; inyectar embriones de 1 célula de pez cebra; incrustar 11 embriones hpf en agarosa para imágenes multiplexadas; y la adquisición de conjuntos de datos 4D de múltiples embriones durante la morfogénesis de la copa óptica (12-24 hpf).

Se puede responder a una gran cantidad de preguntas con estos conjuntos de datos densos en información. Los datos 4D se pueden visualizar y analizar cuantitativamente de varias maneras. Aunque fuera del alcance de este protocolo, incluimos aquí algunos de nuestros objetivos y aplicaciones estándar como ejemplo de los tipos de cosas que se pueden lograr. Por supuesto, los métodos de análisis cuantitativo de imágenes se desarrollan constantemente, y se pueden utilizar herramientas disponibles comercialmente y personalizadas. Si uno no ha utilizado tales métodos antes, uno debe estar preparado para trabajar a través de alguna optimización para garantizar que los conjuntos de datos adquiridos sean adecuados para el enfoque de análisis cuantitativo de elección.

Visualizar y evaluar cuantitativamente los conjuntos de datos 4D puede ser un desafío, debido al tamaño de los archivos. El software de adquisición se puede utilizar para separar los conjuntos de datos en embriones individuales, e ImageJ / Fiji se puede utilizar para convertir archivos confocales de formatos comerciales a pilas tif más estándar, en las que cada punto de tiempo se guarda como un archivo separado. Esto disminuirá el tamaño de los archivos y estandarizará los formatos de archivo. Las secciones ópticas individuales de cada punto de tiempo se pueden ensamblar como un lapso de tiempo 2D (XY) utilizando ImageJ / Fiji, lo que permite una rápida visualización y evaluación 2D de los datos. La película 1 es un ejemplo de precisamente esto: una sola sección óptica a lo largo del tiempo ensamblada como un lapso de tiempo de la muestra óptima que se muestra en la Figura 4I–I”’. A partir de ahí, para la visualización 3D y 4D, comúnmente usamos FluoRender35,36,que está disponible gratuitamente pero tiene requisitos específicos de tarjeta gráfica. Usando FluoRender, uno puede rotar datos renderizados en 3D en cualquier eje, visualizar el conjunto de datos en 4D a lo largo del tiempo, generar recortes en cualquier plano y guardar las rotaciones y visualizaciones como una película o serie de imágenes tif.

En términos de análisis cuantitativo, hay numerosas preguntas que deben responderse. Hemos desarrollado software internamente para ayudar a nuestros propios objetivos específicos de comprender los comportamientos celulares subyacentes a la morfogénesis de la copa óptica. Nuestro programa, LongTracker, utiliza la señal nuclear como un proxy de posición para rastrear las células13. Con estos datos, podemos determinar cuándo, dónde y cómo se mueven las células; qué tan rápido y qué tan lejos se mueven las células; y con qué frecuencia se dividen las células. Además de nuestro propio software, hay múltiples opciones disponibles comercialmente y personalizadas para el seguimiento de células 4D. También hemos desarrollado el programa LongAxis para llevar a cabo la segmentación celular y cuantificar la forma y organización celular dentro de la retina neural37. Los conjuntos de datos introducidos en LongAxis, sin embargo, son pilas Z individuales, tomadas a una alta resolución. Un desafío persistente ha sido generar conjuntos de datos de lapso de tiempo con una resolución lo suficientemente alta como para que las células puedan segmentarse con confianza y extrapolarse su morfología. Una alternativa es el etiquetado en mosaico (escaso) utilizando un fluoróforo fotoconvertible como Kaede para la visualización directa de la forma celular, como nosotros y otros hemos llevado a cabo en el ojo en desarrollo8,11,13. Esto simplifica el problema de segmentación celular, y la forma y el tamaño de la celda se pueden cuantificar fácilmente a través de la representación 3D en FluoRender.

Cada paso de este protocolo fue optimizado específicamente para nuestros propósitos. La especificidad de este protocolo resulta en varias limitaciones: el protocolo, tal como está escrito, no está optimizado para obtener imágenes de otros aspectos del desarrollo del ojo de pez cebra (como la neurogénesis retiniana), otras estructuras oculares, otras etapas de desarrollo u otros compartimentos subcelulares. La orientación de la incrustación, la velocidad de las imágenes y las etiquetas están diseñadas para permitirnos responder a nuestras preguntas biológicas. Con el fin de obtener imágenes de la neurogénesis retiniana, por ejemplo, la orientación dorsal del embrión como se describe aquí puede no permitir la visualización de características específicas de interés, y la velocidad de la imagen puede no ser apropiada. Muchos aspectos del protocolo se pueden adaptar y modificar para una variedad de necesidades, dependiendo de los intereses y objetivos específicos de cada uno. En primer lugar, el uso de inyecciones de ARN hace que el proceso de etiquetado sea muy flexible. Las construcciones de fusión de proteínas fluorescentes se pueden usar para etiquetar estructuras subcelulares de interés, y la cantidad de inyección de ARN se puede variar para optimizar el etiquetado. Basándonos en nuestro trabajo con el fluoróforo fotoconvertible Kaede, las inyecciones de ARN parecen soportar una ráfaga de traslación que se supera en 12 hpf11,13. Los altos niveles de expresión de proteínas fluorescentes a partir de la inyección de ARN podrían combatir el fotobleaching, pero tal enfoque no admite la expresión sostenida de la etiqueta fluorescente de interés. Si es necesaria una expresión sostenida, como cuando se obtenn imágenes de embriones en etapas posteriores, las líneas transgénicas son una opción, y la construcción de nuevas líneas en el pez cebra es sencilla24.

A continuación, el protocolo se puede adaptar para etapas posteriores de desarrollo. Debido a que el pigmento puede impedir la obtención de imágenes en etapas posteriores, los embriones pueden tratarse con fenilterea (PTU) para inhibir la formación de pigmentos, o se pueden usar mutantes genéticos para la síntesis de pigmentos. Para prevenir la contracción embrionaria, se puede agregar tricaína a las soluciones de superposición de agarosa y medios embrionarios, y el porcentaje de agarosa se puede ajustar según sea necesario. A medida que el ojo crece, puede ser necesario cambiar la orientación del montaje; aquí, montamos embriones dorsalmente, pero en etapas posteriores, puede tener más sentido montar lateralmente o anteriormente, dependiendo de la estructura de interés. Debido a que se producen diferentes procesos en diferentes escalas espaciales y temporales, también se puede optimizar el paso Z y el paso de tiempo de la adquisición de imágenes. Estas características realmente solo se pueden determinar empíricamente para las necesidades de cada laboratorio.

Finalmente, este protocolo fue desarrollado específicamente para un microscopio confocal de barrido láser, con embriones incrustados en un porcentaje relativamente alto de agarosa en una etapa temprana del desarrollo ocular. Si se están torndo imágenes en diferentes momentos o diferentes ubicaciones durante el desarrollo del ojo, este protocolo deberá adaptarse al proceso de interés. Actualmente son posibles muchos enfoques de imagen diferentes, y los ingenieros ópticos están desarrollando más. Cada enfoque trae su propio conjunto de desafíos, desde diferentes formas de incrustar y montar embriones para imágenes, hasta diferentes tamaños y formatos de archivo. Esbozamos consideraciones en la introducción para guiar el proceso de optimización, en el que la resolución espacial y temporal máxima se equilibra con el fotobleaching, la fototoxicidad y los inmensos tamaños de archivo. Esperamos que estos principios generales, además de la información práctica descrita anteriormente, ayuden a otros a establecer enfoques de imágenes de lapso de tiempo para estudiar las muchas preguntas abiertas en el desarrollo ocular.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros pasados y presentes del Laboratorio Kwan por el trabajo en los enfoques de lapso de tiempo y las discusiones de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01 EY025378 y R01 EY025780 a KMK; F31 EY030758 a SL; y T32 GM007464 a MAC).

Materials

Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss
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References

  1. Adler, R., Canto-Soler, M. V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies. Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).
  2. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  3. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  4. Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. Shaping the vertebrate eye. Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).
  5. Yang, X. J. Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).
  6. Bogdanovic, O., et al. Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis. Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).
  7. Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly. Development. 147 (4), (2020).
  8. Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis. Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).
  9. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).
  10. England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia. Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).
  11. Gordon, H. B., et al. Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis. Development. 145 (22), (2018).
  12. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  13. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  14. Martinez-Morales, J. R., et al. Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
  15. Miesfeld, J. B., et al. Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate. Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).
  16. Nicolas-Perez, M., et al. Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis. eLife. 5, (2016).
  17. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), e1000214 (2009).
  18. Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).
  19. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, (2017).
  20. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  21. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  22. Nusslein-Volhard, C. The zebrafish issue of Development. Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).
  23. Hoshijima, K., et al. Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish. Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).
  24. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  25. Almeida, A. D., et al. Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina. Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).
  26. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  27. Clark, B. S., et al. Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis. Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).
  28. Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).
  29. Kay, J. N., et al. Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers. Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).
  30. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  31. Suzuki, S. C., et al. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  32. Wan, Y., et al. The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue. Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).
  33. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  34. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  35. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).
  36. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research. IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).
  37. Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation. Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).

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Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).
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