Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.
Die visuelle Systemfunktion erfordert die Etablierung präziser Gewebe- und Organstrukturen. Im Wirbeltierauge sind strukturelle Defekte eine häufige Ursache für Sehstörungen, aber die Mechanismen der Augenmorphogenese sind noch wenig verstanden. Die Grundorganisation des embryonalen Auges bleibt bei allen Wirbeltieren erhalten, so dass die Live-Bildgebung von Zebrafischembryonen zu einem leistungsstarken Ansatz geworden ist, um die Augenentwicklung unter normalen und pathologischen Bedingungen in Echtzeit direkt zu beobachten. Dynamische Zellprozesse wie Bewegungen, Morphologien, Interaktionen, Teilung und Tod können im Embryo visualisiert werden. Wir haben Methoden zur einheitlichen Markierung subzellulärer Strukturen und zur konfokalen Zeitraffermikroskopie der frühen Augenentwicklung bei Zebrafischen entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Erzeugung von gekappter mRNA für die Injektion in den 1-Zell-Zebrafischembryo, zur Montage von Embryonen im optischen Vesikelstadium (~ 12 Stunden nach der Befruchtung, hpf) und zur Durchführung einer mehrdimensionalen Zeitrafferbildgebung der optischen Cup-Morphogenese auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, so dass mehrere Datensätze nacheinander in derselben Bildgebungssitzung erfasst werden. Ein solcher Ansatz liefert Daten, die für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden können, einschließlich Zellverfolgung, Volumenmessungen, dreidimensionalem (3D) Rendering und Visualisierung. Unsere Ansätze ermöglichen es uns, die zellulären und molekularen Mechanismen zu lokalisieren, die die Entwicklung von optischen Bechern vorantreiben, sowohl unter Wildtyp- als auch unter genetischen Mutantenbedingungen. Diese Methoden können direkt von anderen Gruppen angewendet oder angepasst werden, um viele zusätzliche Aspekte der Zebrafischaugenentwicklung zu visualisieren.
Die Entwicklung des Wirbeltierauges beginnt mit der Entstehung oder Evagination der optischen Vesikel aus dem prospektiven Neuroepithel des Gehirns. Die optischen Vesikel durchlaufen dann eine Reihe von Gewebeformänderungen, die sich ausdereckn und dann invaginieren, um den optischen Becher zu erzeugen. Im optischen Becher umhüllen die neurale Netzhaut und das retinale Pigmentepithel, die beide vom Neuroepithel abgeleitet sind, die entstehende Linse, die vom Oberflächenektoderm abgeleitet ist. Der gesamte Prozess erfordert eine komplexe Reihe von Zell- und Gewebebewegungen und molekularen Signalen, die zwischen Neuroepithel-, Ektoderm- und mesenchymalen Zellpopulationen koordiniert werden. Diese ersten Ereignisse legen die Grundstruktur des Auges fest, und spätere Schritte der Augenentwicklung, einschließlich iris- und hornhautbildung, sind Ausarbeitungen zur frühen Organisation. Störungen der frühen Augenentwicklung und Morphogenese liegen zahlreichen Sehstörungen beim Menschen zugrunde, einschließlich Anophthalmie, Mikrophthalmie und Kolobom. Die Entschlüsselung der zellulären und molekularen Mechanismen, die die Morphogenese des optischen Bechers steuern, ist entscheidend für das weitere Verständnis der visuellen Systementwicklung und der pathologischen Bedingungen, die sich ergeben, wenn diese Prozesse schief gehen.
Unser Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieraugen und der Morphogenese entstand aus einer enormen Menge an Arbeit, die von klassischen histologischen Studien bis hin zu embryologischen und genetischen Ansätzen in einer Vielzahl von Modellorganismen wie Maus, Küken, Frosch undFischen reicht 1,2,3,4,5. Während diese Arbeit molekulare Mechanismen etablierte, die die frühe Augenentwicklung regulieren, gibt es historisch ein schlechtes Verständnis der Morphogenese des Auges: die Entstehung seiner 3D-Struktur. Der Großteil dieser Ergebnisse stammt aus der Bildgebung von abschnittierten Embryonen zu diskreten Zeitpunkten. Während dies ausreicht, um einen Überblick über die Gewebemorphologie in 2 Dimensionen zu geben, ist die Morphogenese ein dynamischer 3D-Prozess. Um festzustellen, wie sich die Form des Gewebes im Laufe der Zeit in 3 Dimensionen verändert, wie sich einzelne Zellen verhalten und wie diese Verhaltensweisen zu Veränderungen der 3D-Gewebeform beitragen, sind verschiedene Ansätze erforderlich.
Eine Lösung, um diese erhebliche Wissenslücke zu schließen, ist die Live-Bildgebung, die eine dynamische Beobachtung von Zellen und Geweben in Echtzeit ermöglicht, während das Organ Gestalt annimmt. Leider ist dies in vielen Modellorganismen aufgrund der Einschränkungen der Embryonalentwicklung nicht ohne weiteres möglich. Zum Beispiel sind Maus- und Kükenembryonen (die sich in utero oder in einer Eierschale entwickeln) nicht leicht zugänglich, und viele lebende Embryonen sind optisch nicht transparent, was zu einer signifikanten Lichtstreuung führt und die Tiefe, in der Bilder aufgenommen werden können, einschränkt. Zebrafische, mit äußerer Entwicklung und transparenten Embryonen, bieten eine einzigartige Gelegenheit, Live-Bildgebung der Augenmorphogenese6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19durchzuführen . Reichlich transgene und mutierte Linien sind ebenfalls verfügbar, sowie Werkzeuge zur Erzeugung neuer Transgene und Mutanten20,21,22,23,24. Darüber hinaus tritt die optische Bechermorphogenese bei Zebrafischen über einen Zeitraum von 12 Stunden (12-24 Stunden nach der Befruchtung, hpf) schnell auf, was die Bildgebung des gesamten Prozesses ermöglicht.
Live-Imaging-Bemühungen wurden durch die Erweiterung und Optimierung der Familie der fluoreszierenden Proteine, die eine genetisch kodierte vitale Markierung subzellulärer Strukturen ermöglichen, sowie verbesserungen und innovationen bei Mikroskopiemethoden beschleunigt. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die konfokale Laserscanning-Mikroskopie anstelle anderer aktueller Ansätze zur Bildgebung der Zebrafischembrogenese, einschließlich der konfokalen Spinnscheibenmikroskopie, der selektiven Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM und ihre Varianten) und anderer spezialisierterer Mikroskopiemethoden. Für das sich entwickelnde Zebrafischauge fanden wir heraus, dass die konfokale Mikroskopie der Spinnscheibe nicht ausreichte, um tiefer im Gewebe zu bilden. Obwohl SPIM eine extrem schnelle Bildgebungszeit aufweist und immer weiter verbreitet wird, bleibt der Umgang mit den großen Datensätzen für die Visualisierung und Analyse eine Herausforderung. Im Gegensatz dazu ist die konfokale Laserscanning-Mikroskopie leicht zugänglich, insbesondere für Personen, die keine Erfahrung in der Montage optischer Hardware haben. Wir hoffen, dass die breite Verfügbarkeit der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie unser Protokoll für viele Labore nützlich machen wird.
Hier beschreiben wir unsere Methode zur Erfassung von 4D-Datensätzen der optischen Cup-Morphogenese, unter Verwendung der In-toto-Markierung des Embryos für Membranen und Chromatin sowie eines laserscannenden konfokalen Mikroskops zur Bildaufnahme (schematisiert in Abbildung 1). Die hier verwendeten fluoreszierenden Proteine (EGFP-CAAX und H2A. F/Z-mCherry) wurden ausgewählt, um gewebemarkierungen mit Einzelzellauflösung bereitzustellen. Wir verwenden Datensätze, die mit diesem Protokoll generiert werden, für eine Vielzahl von Bildanalyse- und Visualisierungsfunktionen. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, wenn andere subzelluläre Strukturen gewünscht werden. Zur Visualisierung der Zellform wurde die Plasmamembranmarkierung ausgewählt: Wir verwenden EGFP-CAAX, bei dem die letzten 21 Aminosäuren von H-ras, die als Prenylierungssignalsequenz dienen, mit dem C-Terminus von EGFP13verschmolzen sind. Andere plasmamembrangerichtete fluoreszierende Proteine (z. B. Transmembranfusion oder myristoylierte) funktionieren wahrscheinlich genauso gut. Um Kerne zu markieren, haben wir H2A ausgewählt. F/Z-mCherry, bei dem mCherry mit einem Histonprotein13verschmolzen ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellteilung einschließlich der mitotischen Spindelorientierung leicht visualisiert werden kann.
Bei jedem Live-Imaging-Ansatz müssen Kompromisse zwischen der Erhöhung der Bildgebungsgeschwindigkeit und der Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses, der axialen Auflösung und der Probenkonservierung berücksichtigt werden. Wir haben unsere Methoden optimiert, um die Bildqualität und die Anzahl der Embryonen, die in einem einzigen Durchlauf abgebildet werden können, zu maximieren. Oft besteht das Ziel darin, die optische Cup-Morphogenese in einem homozygoten mutierten Embryo abbilden, der zu Beginn der optischen Cup-Morphogenese und der Nachkommen einer heterozygoten Kreuzung phänotypisch nicht vom Wildtyp zu unterscheiden ist (25% der Embryonen sind der gewünschte Genotyp). Durch die Optimierung und anschließende Multiplexing der Bildaufnahme besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, einen Datensatz eines homozygoten mutierten Embryos zu erfassen.
Die zeitliche Auflösung oder die Art und Weise, wie häufig Volumendaten (Z-Stacks) erfasst werden, ist ein Schlüsselaspekt der Zeitrafferbildgebung. Je nach Verwendungszweck solcher Datensätze gibt es unterschiedliche Anforderungen an die Geschwindigkeit. Ursprünglich wurde dieses Protokoll für die manuelle 4D-Zellverfolgung entwickelt. Die Verfolgung einzelner Zellen innerhalb eines gleichmäßig markierten Gewebes erfordert eine ausreichend hohe zeitliche Auflösung, um die Gewissheit zu schaffen, dass eine Einzelne Zelle im Laufe der Zeit kontinuierlich verfolgt wird. Wir fanden heraus, dass Z-Stapel der Zebrafisch-Optikbechermorphogenese mindestens alle 3,1 minuten über 12 h erworben werden müssen; hier haben wir unsere Erfassung an einem laserscannenden konfokalen Mikroskop so optimiert, dass wir alle 2,5 min Z-Stacks von 4-5 Embryonen erfassen können.
Die Festlegung der Z-Schritt-Größe war ein entscheidender Schritt in der Protokolloptimierung: Für 3D-Rendering und Visualisierung sind isotrope Daten ideal, bei denen die Z-Schritt-Größe gleich der XY-Pixeldimension ist. In der Realität ist es extrem schwierig, solche Zeitrafferdaten mit Live-Proben zu erfassen, da die Bildgebungszeit und das Photobleaching einschränkungen sind. Daher ist die Bestimmung der angemessenen Z-Schrittgröße wichtig für die Rendering- und Visualisierungsanforderungen des Experiments und insbesondere für das X:Y:Z-Voxelverhältnis, das benötigt wird, um die axiale Information zu maximieren und gleichzeitig die Geschwindigkeit beizubehalten und Photobleaching zu verhindern. Für dieses Protokoll wurde ein Voxelverhältnis von 1:1:3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-Schrittgröße mit einem 40-fach langen Wasserimmersionsobjektiv mit arbeitsabstand) festgelegt. Bei einer Z-Tiefe von 130-140 μm ergeben sich Volumendaten mit geeigneter zeitlicher Auflösung und wenig Photobleaching.
Wie oben besprochen, ist dieses Protokoll spezifisch für die 4D-Bildgebung der Zebrafisch-Optikbechermorphogenese, bei der Embryonen in Toto verwendet werden, die für Plasmamembran und Chromatin markiert sind, und ein laserscannendes konfokales Mikroskop. Das folgende Protokoll kann leicht für eine Vielzahl von Experimenten und Bedürfnissen angepasst werden. Erstens kann in Bezug auf subzelluläre Strukturen jede Struktur abgebildet werden, für die ein lebender Zellmarker existiert. Obwohl der Fokus hier ausschließlich auf der Morphogenese des optischen Bechers liegt, kann die Zeitrafferbildgebung für andere Stadien der Augenentwicklung angepasst werden, z. B. Neurogenese25,26,27,28,29,30,31,32,33. Für die spätere Entwicklung der Bildgebung muss möglicherweise die Immobilisierung des Embryos (da die spontane Muskelaktivität bei etwa 24 PSF beginnt), die Pigmentierung (die bei etwa 24 PSf zu entstehen beginnt), die Gewebegröße (das Auge wächst während der Neurogenese signifikant an Volumen) und die Bildgebungsgeschwindigkeit (die je nach Geschwindigkeit des interessierenden Prozesses angepasst werden sollte) in Betracht gezogen werden. All diese Überlegungen können leicht verwaltet werden. Das Protokoll ist sehr flexibel; Zusätzlich zu den Details des spezifischen Protokolls gibt es hier allgemeine Prinzipien, die denjenigen helfen, die sich für Live-Bildgebung interessieren, andere Aspekte der Augenentwicklung.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die In-toto-Markierung und 4D-Zeitrafferbildgebung der optischen Cup-Morphogenese. Wir durchlaufen den Prozess der Erzeugung von Capped RNA, die fluoreszierende Proteine kodiert, um verschiedene subzelluläre Kompartimente zu markieren. Injektion von Zebrafisch-1-Zellen-Embryonen; Einbettung von 11 HPF-Embryonen in Agarose für die multiplexierte Bildgebung; und Erwerb von 4D-Datensätzen mehrerer Embryonen für die Dauer der optischen Cup-Morphogenese (12-24 HPF).
Mit diesen informationsreichen Datensätzen lassen sich unzählige Fragen beantworten. 4D-Daten können auf vielfältige Weise visualisiert und quantitativ analysiert werden. Obwohl außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls, schließen wir hier einige unserer Ziele und Standardanwendungen als Beispiel für die Arten von Dingen ein, die erreicht werden können. Natürlich werden quantitative Bildanalysemethoden ständig weiterentwickelt und es können sowohl handelsübliche als auch kundenspezifische Werkzeuge verwendet werden. Wenn man solche Methoden noch nicht verwendet hat, sollte man bereit sein, einige Optimierungen durchzuführen, um sicherzustellen, dass die erworbenen Datensätze für den quantitativen Analyseansatz der Wahl geeignet sind.
Die Visualisierung und quantitative Auswertung der 4D-Datensätze kann aufgrund der Größe der Dateien eine Herausforderung darstellen. Die Erfassungssoftware kann verwendet werden, um die Datensätze in einzelne Embryonen zu trennen, und ImageJ / Fiji kann verwendet werden, um konfokale Dateien von kommerziellen Formaten in Standard-TIF-Stacks zu konvertieren, in denen jeder Zeitpunkt als separate Datei gespeichert wird. Dadurch werden die Dateigrößen verringert und die Dateiformate standardisiert. Einzelne optische Schnitte aus jedem Zeitpunkt können mit ImageJ/Fiji als 2D (XY) Zeitraffer zusammengesetzt werden, was eine schnelle 2D-Visualisierung und Auswertung der Daten ermöglicht. Film 1 ist ein Beispiel dafür: ein einzelner optischer Abschnitt im Laufe der Zeit, der als Zeitraffer der in Abbildung 4I– I”’gezeigten optimalen Probe zusammengesetzt wurde. Von dort aus verwenden wir für die 3D- und 4D-Visualisierung häufig FluoRender35,36, das frei verfügbar ist, aber spezifische Grafikkartenanforderungen hat. Mit FluoRender kann man 3D-gerenderte Daten in jeder Achse drehen, den Datensatz im Laufe der Zeit in 4D visualisieren, Cutaways in jeder Ebene generieren und die Drehungen und Visualisierungen als Film oder eine Reihe von TIF-Bildern speichern.
In Bezug auf die quantitative Analyse gibt es zahlreiche Fragen zu beantworten. Wir haben software intern entwickelt, um unsere eigenen spezifischen Ziele zu unterstützen, das Zellverhalten zu verstehen, das der optischen Cup-Morphogenese zugrunde liegt. Unser Programm, LongTracker, verwendet das Kernsignal als Proxy für die Position, um Zellen13zu verfolgen. Mit diesen Daten können wir bestimmen, wann, wo und wie sich Zellen bewegen; wie schnell und wie weit sich Zellen bewegen; und wie häufig sich Zellen teilen. Zusätzlich zu unserer eigenen Software gibt es mehrere kommerziell erhältliche und maßgeschneiderte Optionen für die 4D-Zellverfolgung. Wir haben auch das Programm LongAxis entwickelt, um Zellsegmentierung durchzuführen und die Zellform und -organisation innerhalb der neuronalen Netzhaut zu quantifizieren37. Die in LongAxis eingegebenen Datensätze sind jedoch einzelne Z-Stacks, die mit hoher Auflösung aufgenommen werden. Eine anhaltende Herausforderung bestand darin, Zeitraffer-Datensätze mit einer ausreichend hohen Auflösung zu generieren, dass Zellen mit Zuversicht segmentiert und ihre Morphologie extrapoliert werden können. Eine Alternative ist die mosaikartige (spärliche) Markierung mit einem photokonvertierbaren Fluorophor wie Kaede zur direkten Visualisierung der Zellform, wie wir und andere im sich entwickelnden Auge8,11,13durchgeführt haben . Dies vereinfacht das Problem der Zellsegmentierung, und Zellform und -größe können durch 3D-Rendering in FluoRender leicht quantifiziert werden.
Jeder Schritt dieses Protokolls wurde speziell für unsere Zwecke optimiert. Die Spezifität dieses Protokolls führt zu mehreren Einschränkungen: Das Protokoll, wie geschrieben, ist nicht für die Abbildung anderer Aspekte der Zebrafischaugenentwicklung (wie retinale Neurogenese), anderer Augenstrukturen, anderer Entwicklungsstadien oder anderer subzellulärer Kompartimente optimiert. Die Ausrichtung der Einbettung, die Geschwindigkeit der Bildgebung und die Etiketten sind alle so konzipiert, dass wir unsere biologischen Fragen beantworten können. Um beispielsweise die retinale Neurogenese abbilden zu können, ist die dorsale Orientierung des Embryos, wie hier beschrieben, möglicherweise nicht möglich, bestimmte Merkmale von Interesse zu visualisieren, und die Geschwindigkeit der Bildgebung ist möglicherweise nicht angemessen. Viele Aspekte des Protokolls können für eine Vielzahl von Bedürfnissen angepasst und modifiziert werden, abhängig von den spezifischen Interessen und Zielen. Erstens macht die Verwendung von RNA-Injektionen den Markierungsprozess sehr flexibel. Fluoreszierende Proteinfusionskonstrukte können verwendet werden, um subzelluläre Strukturen von Interesse zu kennzeichnen, und die RNA-Injektionsmenge kann variiert werden, um die Markierung zu optimieren. Basierend auf unserer Arbeit mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Kaede scheinen RNA-Injektionen einen Translationsschub zu unterstützen, der um 12 hpf11,13vorbei ist. Ein hoher Anteil an fluoreszierender Proteinexpression durch RNA-Injektion könnte photobleaching bekämpfen, aber ein solcher Ansatz unterstützt keine anhaltende Expression der fluoreszierenden Markierung von Interesse. Wenn eine anhaltende Expression erforderlich ist, z. B. bei der Bildgebung von Embryonen in späteren Stadien, sind transgene Linien eine Option, und die Konstruktion neuer Linien in Zebrafischen ist einfach24.
Als nächstes kann das Protokoll für spätere Entwicklungsstadien angepasst werden. Da Pigmente die Bildgebung in späteren Stadien behindern können, können Embryonen mit Phenylthiourea (PTU) behandelt werden, um die Pigmentbildung zu hemmen, oder genetische Mutanten für die Pigmentsynthese können verwendet werden. Um ein Zucken des Embryos zu verhindern, kann Tricain zu den Agarose- und Embryomedien-Overlay-Lösungen hinzugefügt werden, und der Prozent der Agarose kann bei Bedarf angepasst werden. Wenn das Auge wächst, kann es notwendig sein, die Montageausrichtung zu ändern. Hier montieren wir Embryonen dorsal, aber in späteren Stadien kann es sinnvoller sein, je nach Struktur seitlich oder anterior zu montieren. Da unterschiedliche Prozesse über unterschiedliche räumliche und zeitliche Skalen ablaufen, kann man auch den Z-Schritt und den Zeitschritt der Bildaufnahme optimieren. Diese Merkmale können wirklich nur empirisch für die Bedürfnisse jedes Labors bestimmt werden.
Schließlich wurde dieses Protokoll speziell für ein laserscannendes konfokales Mikroskop entwickelt, bei dem Embryonen in einem relativ hohen Prozentsatz an Agarose in einem frühen Stadium der Augenentwicklung eingebettet sind. Wenn man während der Augenentwicklung zu verschiedenen Zeiten oder an verschiedenen Orten bildgebung, muss dieses Protokoll für den interessierenden Prozess angepasst werden. Derzeit sind viele verschiedene Bildgebungsansätze möglich, weitere werden von Optikern entwickelt. Jeder Ansatz bringt seine eigenen Herausforderungen mit sich, von verschiedenen Möglichkeiten, Embryonen für die Bildgebung einzubetten und zu montieren, bis hin zu unterschiedlichen Dateigrößen und Formaten. Wir skizzieren in der Einleitung Überlegungen, um den Optimierungsprozess zu leiten, bei dem maximale räumliche und zeitliche Auflösung mit Photobleaching, Phototoxizität und immensen Dateigrößen ausgeglichen werden. Wir hoffen, dass diese allgemeinen Prinzipien zusätzlich zu den oben beschriebenen praktischen Informationen anderen helfen werden, Zeitraffer-Bildgebungsansätze zu etablieren, um die vielen offenen Fragen in der Augenentwicklung zu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Kwan Lab für die Arbeit an Zeitrafferansätzen und Diskussionen zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde vom NIH (R01 EY025378 und R01 EY025780 bis KMK; F31 EY030758 bis SL; und T32 GM007464 zu MAC).
Delta TPG Dish 0.17mm clear | Bioptechs | 0420041500C | coverglass bottom for optical compatibility |
Disposable Pasteur Pipettes | VWR | 14672-608 | overall length 14.6 cm (53/4") |
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter | P-97 | |
Immersol W | Carl Zeiss Microscopy | 4449690000000 | immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence |
Microinjection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side. |
Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL |
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature. |
Nikon SMZ645 Stereo Microscope | Nikon | SMZ645 | used for injecting embryos (see Fig. 2B) |
NotI-HF enzyme | NEB | R3189S | comes with Gel Loading Dye, Purple (6X) |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | fine resolution, low melt agarose |
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 | Carl Zeiss Microscopy | 421867-9970-000 | |
Olympus SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX2-ZB16 | used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A) |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested |
Pico-liter Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold |
Pipette Pump Pipettor | SP Bel-Art | F37898 | fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying |
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | 1.0 x 0.78 mm |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml) |
RNase-free H2O | Invitrogen | AM9906 | DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers |
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9000-000 | |
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9030-000 | |
Zeiss LSM 880 with Airyscan | Carl Zeiss Microscopy | N/A | inverted Axio Observer microscope |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss |