يصف هذا البروتوكول نهجا لوضع العلامات في توتو والتصوير متعدد الأبعاد لسمك الحمار الوحشي في وقت مبكر من نمو العين. نحن نصف وضع العلامات والتضمين والتصوير رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر confocal المسح بالليزر ، واعتبارات لتحسين الحصول على مجموعات البيانات لتشريح آليات مورفوجينيسيس كوب البصرية.
تتطلب وظيفة النظام البصري إنشاء هياكل دقيقة للأنسجة والأعضاء. في العين الفقارية ، والعيوب الهيكلية هي سبب شائع لضعف البصر ، ولكن آليات تكوين العين لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. يتم الحفاظ على التنظيم الأساسي للعين الجنينية في جميع أنحاء الفقاريات ، وبالتالي أصبح التصوير الحي لأجنة حمار وحشي نهجا قويا لمراقبة نمو العين مباشرة في الوقت الحقيقي في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. يمكن تصور عمليات الخلايا الديناميكية بما في ذلك الحركات والمورفولوجيا والتفاعلات والانقسام والموت في الجنين. لقد طورنا أساليب لوضع علامات موحدة على الهياكل دون الخلوية والمجهر الكونفوجال الفاصل زمنيا لتطور العين المبكر في سمك الحمار الوحشي. يحدد هذا البروتوكول طريقة توليد الحمض النووي الريبي المتوج للحقن في جنين حمار وحشي مكون من خلية واحدة ، وتركيب الأجنة في مرحلة الحويكل البصري (~ 12 ساعة بعد الإخصاب ، hpf) ، وإجراء تصوير متعدد الأبعاد لخلايا الزمن لتشريب تكوين كوب البصري على مجهر كونفولوجي للمسح بالليزر ، بحيث يتم الحصول على مجموعات بيانات متعددة بشكل متسلسل في نفس جلسة التصوير. ينتج عن مثل هذا النهج بيانات يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الأغراض، بما في ذلك تتبع الخلايا، وقياسات الحجم، والتجسيد ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد)، والتصور. تسمح لنا مقارباتنا بتحديد الآليات الخلوية والجزيئية التي تقود تطوير الكأس البصرية ، في كل من النوع البري وظروف المتحولة الوراثية. يمكن استخدام هذه الطرق مباشرة من قبل مجموعات أخرى أو تكييفها لتصور العديد من الجوانب الإضافية لتطوير العين حمار وحشي.
يبدأ تطور العين الفقارية بظهور الحويصلات البصرية من الظهارة العصبية الدماغية المحتملة، أو التشنج. الحويصلات البصرية ثم الخضوع لسلسلة من التغييرات شكل الأنسجة، وإطالة ومن ثم التجهم لتوليد الكأس البصرية. في الكأس البصري، تقوم شبكية العين العصبية وظهارة صبغة الشبكية، وكلاهما مشتق من الظهارة العصبية، بتغليف العدسة الوليدة، المشتقة من ectoderm السطح. تتطلب العملية بأكملها سلسلة معقدة من حركات الخلايا والأنسجة والإشارات الجزيئية ، منسقة بين الظهارة العصبية ، ectoderm ، وتجمعات الخلايا الميكنشيمالية. هذه الأحداث الأولية إنشاء الهيكل الأساسي للعين، والخطوات اللاحقة لتطوير العين، بما في ذلك القزحية وتشكيل القرنية، هي تفاصيل عن التنظيم المبكر. اضطرابات في نمو العين في وقت مبكر و morphogenesis تكمن وراء العديد من ظروف ضعف البصر في البشر، بما في ذلك الأنوفثالميا، ميكروفثالميا، و coloboma. فتح الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم مورفوجينيسيس كأس البصرية أمر بالغ الأهمية لمزيد من فهم تطوير النظام البصري والظروف المرضية التي تنتج عندما تذهب هذه العمليات منحرف.
وقد انبثق فهمنا لتطور العين الفقارية والمورفوجين من كمية هائلة من العمل تمتد الدراسات النسيجية الكلاسيكية إلى النهج الجنينية والجينية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية بما في ذلك الماوس والفرخ والضفدع والأسماك1و2و3و4و5. في حين أن هذا الجسم من العمل أنشأت الآليات الجزيئية التي تنظم نمو العين في وقت مبكر، تاريخيا هناك فهم ضعيف لمورفوجينيس العين: ظهور هيكلها 3D. وقد جاء الجزء الأكبر من هذه النتائج من الأجنة المقطعية التصوير في نقاط زمنية منفصلة. في حين أن هذا يكفي لتوفير رؤية لمورفولوجيا الأنسجة في بعدين ، فإن مورفوجينيسيس هي عملية ديناميكية ثلاثية الأبعاد. من أجل تحديد كيفية تغير شكل الأنسجة في 3 أبعاد مع مرور الوقت ، وكيف تتصرف الخلايا المفردة ، وكيف تساهم هذه السلوكيات في التغيرات في شكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، من الضروري اتباع نهج مختلفة.
أحد الحلول لمعالجة هذه الفجوة الكبيرة في المعرفة هو التصوير الحي ، والذي يتيح المراقبة الديناميكية للخلايا والأنسجة في الوقت الحقيقي مع تشكيل العضو. لسوء الحظ، هذا ليس ممكنا بسهولة في العديد من الكائنات النموذجية بسبب قيود النمو الجنيني. على سبيل المثال، لا يمكن الوصول بسهولة إلى أجنة الفئران والفراخ (التي تتطور في الرحم أو داخل قشر البيض)، والعديد من الأجنة الحية ليست شفافة بصريا، مما يسبب تشتتا خفيفا كبيرا ويحد من العمق الذي يمكن الحصول على الصور إليه. Zebrafish، مع التنمية الخارجية والأجنة شفافة، وتوفير فرصة فريدة للقيام بالتصوير الحي للعيون morphogenesis6،7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19. كما تتوفر خطوط واسعة المعدلة وراثيا ومتحولة، فضلا عن أدوات لتوليد المعدلات الجديدة والمسوخ20،21،22،23،24. وعلاوة على ذلك، يحدث شكل التشكل للكوب البصري بسرعة في سمك الحمار الوحشي، على مدى 12 ساعة (12-24 ساعة بعد الإخصاب، hpf)، مما يجعل تصوير العملية برمتها ممكنا.
وقد تسارعت جهود التصوير الحي من خلال توسيع وتحسين عائلة البروتينات الفلورية ، والتي تسمح بوضع علامات حيوية مشفرة وراثيا للهياكل دون الخلوية ، فضلا عن التحسينات والابتكارات في طرق المجهر. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا المجهر الكونفوجال المسح بالليزر ، بدلا من النهج الحالية الأخرى لتصوير تكوين جنين حمار وحشي ، بما في ذلك المجهر الكونفوجال القرص الغزل ، المجهر إضاءة الطائرة الانتقائية (SPIM ومتغيراتها) ، وغيرها من أساليب المجهر أكثر تخصصا. بالنسبة لعين حمار وحشي النامية ، وجدنا أن المجهر الكونفوجال القرص الغزل لم يكن كافيا للتصوير أعمق في الأنسجة. على الرغم من أن SPIM تفتخر بوقت تصوير سريع للغاية وأصبحت تستخدم على نطاق أوسع ، إلا أن التعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة للتصور والتحليل لا يزال يمثل تحديا. وعلى النقيض من ذلك، يمكن الوصول بسهولة إلى المجهر البؤري بالليزر، وخاصة بالنسبة للأفراد الذين يفتقرون إلى الخبرة في تجميع الأجهزة البصرية. نأمل أن التوافر الواسع للفحص بالليزر المجهري confocal سيجعل بروتوكولنا مفيدا للعديد من المختبرات.
هنا، ونحن نصف طريقتنا لالتقاط مجموعات البيانات 4D من مورفوجينيسيس كأس البصرية، وذلك باستخدام في توتو وضع العلامات على الجنين للأغشية والكروماتين، والمجهر confocal المسح بالليزر للحصول على صورة (مخطط في الشكل 1). البروتينات الفلورية المستخدمة هنا (EGFP-CAAX و H2A. تم اختيار F/Z-mCherry) لتوفير وضع العلامات على الأنسجة بدقة خلية واحدة. نحن نستخدم مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من وظائف تحليل الصور والتصور. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة إذا كانت هناك رغبة في هياكل فرعية أخرى. تم اختيار وضع العلامات غشاء البلازما لتصور شكل الخلية: نحن نستخدم EGFP-CAAX، حيث يتم دمج الأحماض الأمينية ال 21 الأخيرة من H-ras، بمثابة تسلسل إشارة ما قبلنيليشن، إلى C-terminus من EGFP13. غشاء البلازما الأخرى المستهدفة البروتينات الفلورية (على سبيل المثال، الانصهار عبر الميمبران أو myristoylated) من المرجح أن تعمل فقط كذلك. للاحتفال النوى، اخترنا H2A. F / Z-mCherry، الذي يتم دمج mCherry إلى بروتين الهستون13. وهذا يضمن أن تقسيم الخلية، بما في ذلك اتجاه المغزل ميتوتيك، هو تصور بسهولة.
مع أي نهج التصوير الحي ، يجب على المرء أن تنظر المفاضلة بين زيادة سرعة التصوير مع تعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، والقرار المحوري ، والحفاظ على العينة. لقد قمنا بتحسين أساليبنا لتحقيق أقصى قدر من جودة الصورة وعدد الأجنة التي يمكن تصويرها في شوط واحد. في كثير من الأحيان ، فإن الهدف هو تصوير تكوين الكوب البصري في جنين متحول متجانس ، والذي قد لا يمكن تمييزه بشكل غير عادي عن النوع البري في بداية تكوين الكوب البصري وذرية تقاطع heterozygous (25٪ من الأجنة هي النمط الجيني المطلوب). من خلال تحسين ، ومن ثم الحصول على صورة متعددة ، هناك احتمال متزايد لالتقاط مجموعة بيانات من جنين متحول متجانس.
الدقة الزمنية، أو عدد المرات التي يتم فيها الحصول على بيانات الحجم (Z-stacks)، هو جانب رئيسي من التصوير الفاصل الزمني. اعتمادا على الغرض من مجموعات البيانات هذه، هناك متطلبات مختلفة للسرعة. في البداية تم تطوير هذا البروتوكول لتتبع الخلايا 4D اليدوي. يتطلب تتبع الخلايا الفردية داخل نسيج يحمل علامة موحدة دقة زمنية عالية بما يكفي لتوفير الثقة في أن أي خلية واحدة يتم تعقبها باستمرار بمرور الوقت. وجدنا أن Z-مداخن من حمار وحشي كأس البصرية مورفوجينيسيس يجب الحصول على الأقل كل 3.1 دقيقة على مدى 12 ساعة; هنا، قمنا بتحسين استحواذنا على مجهر كونفوجكال ليزر بحيث يمكننا الحصول على Z-مداخن من 4-5 أجنة كل 2.5 دقيقة.
كان إنشاء حجم Z-step خطوة حاسمة في تحسين البروتوكول: بالنسبة للعرض والتصور ثلاثي الأبعاد ، تعد البيانات متساوية الخواص مثالية ، حيث يساوي حجم Z-step بعد بكسل XY. في الواقع ، من الصعب للغاية الحصول على بيانات الفاصل الزمني هذه مع عينات حية ، نظرا للقيود مع وقت التصوير وphotobleaching. ولذلك، تحديد حجم Z-الخطوة كافية مهم لتقديم والتصور احتياجات التجربة، وعلى وجه التحديد، ما X:Y:Z نسبة voxel مطلوب لتحقيق أقصى قدر من المعلومات المحورية مع الحفاظ على السرعة ومنع photobleaching. بالنسبة لهذا البروتوكول، كانت نسبة voxel المنشأة 1:1:3.5 (0.6 ميكرومتر × 0.6 ميكرومتر × 2.1 ميكرومتر من حجم الخطوة Z باستخدام هدف غمر المياه لمسافات العمل الطويلة 40x). عند الحصول على عمق Z من 130-140 ميكرومتر ، وهذا يعطي بيانات حجم مع دقة زمنية مناسبة والقليل من photobleaching.
كما نوقش أعلاه، هذا البروتوكول هو محدد للتصوير 4D من مورفوجينيسيس كأس الحمار الوحشي البصرية، وذلك باستخدام الأجنة في توتو المسمى لغشاء البلازما والكروماتين، والمجهر confocal المسح بالليزر. يمكن تكييف البروتوكول أدناه بسهولة لمجموعة متنوعة من التجارب والاحتياجات. أولا، فيما يتعلق بالهياكل دون الخلوية، يمكن تصوير أي بنية توجد لها علامة خلية حية. بعد ذلك ، على الرغم من أن التركيز هنا يقتصر على تكوين الأكواب البصرية ، إلا أنه يمكن تكييف تصوير الفاصل الزمني للمراحل الأخرى من تطور العين ، على سبيل المثال ، تكوين الأعصاب25،26،27،28،29،30،31،32،33. للتصوير في وقت لاحق التنمية، قد تحتاج إلى النظر في شل الجنين (كما يبدأ نشاط العضلات العفوية حوالي 24 حصان)، تصبغ (الذي يبدأ في الظهور حوالي 24 حصان)، وحجم الأنسجة (العين ينمو بشكل كبير في حجم أثناء تكوين الأعصاب)، وسرعة التصوير (والتي ينبغي تعديلها اعتمادا على سرعة عملية الاهتمام). ويمكن إدارة جميع هذه الاعتبارات بسهولة. البروتوكول مرن جدا؛ بالإضافة إلى تفاصيل البروتوكول المحدد هنا ، هناك مبادئ عامة من شأنها أن تساعد المهتمين في التصوير الحي جوانب أخرى من تطور العين.
هنا، ونحن نصف بروتوكول لوضع العلامات في توتو والتصوير الفاصل الزمني 4D من مورفوجينيسيس كأس البصرية. نحن خطوة من خلال عملية توليد توج الحمض النووي الريبي ترميز البروتينات الفلورية لوضع علامة على مقصورات فرعية مختلفة; حقن حمار وحشي 1-خلية الأجنة; تضمين 11 جنين hpf في agarose للتصوير متعدد المضاعفات؛ والحصول على مجموعات بيانات رباعية الأبعاد لأجنة متعددة طوال مدة تكوين الكوب البصري (12-24 حصان).
يمكن الإجابة على عدد لا يحصى من الأسئلة من خلال مجموعات البيانات الكثيفة المعلومات هذه. يمكن تصور البيانات 4D وتحليلها كميا في مجموعة متنوعة من الطرق. على الرغم من أن خارج نطاق هذا البروتوكول، ونحن تشمل هنا بعض أهدافنا والتطبيقات القياسية كمثال على أنواع الأشياء التي يمكن تحقيقها. وبطبيعة الحال، يجري باستمرار تطوير أساليب تحليل الصور الكمية، ويمكن استخدام الأدوات المتاحة تجاريا والمصطنة خصيصا على حد سواء. وإذا لم يستخدم المرء هذه الأساليب من قبل، فينبغي أن يكون مستعدا للعمل من خلال بعض التحسين لضمان أن تكون مجموعات البيانات المكتسبة كافية لنهج التحليل الكمي الذي يختاره.
يمكن أن يكون تصور مجموعات البيانات ذات الأبعاد الرابعة وتقييمها كميا أمرا صعبا ، نظرا لحجم الملفات. يمكن استخدام برنامج الاستحواذ لفصل مجموعات البيانات إلى أجنة فردية ، ويمكن استخدام ImageJ / Fiji لتحويل الملفات الكونفوجال من الأشكال التجارية إلى أكوام tif قياسية أكثر ، حيث يتم حفظ كل نقطة زمنية كملف منفصل. سيؤدي ذلك إلى تقليل أحجام الملفات وتوحيد تنسيقات الملفات. يمكن تجميع المقاطع البصرية الفردية من كل نقطة زمنية لفترة زمنية 2D (XY) باستخدام ImageJ / Fiji ، مما يتيح التصور السريع 2D وتقييم البيانات. الفيلم 1 هو مثال على هذا على وجه التحديد: مقطع بصري واحد مع مرور الوقت تجميعها فترة زمنية للعينة الأمثل هو مبين في الشكل 4I-I”. من هناك ، لتصور 3D و 4D ، ونحن عادة استخدام FluoRender35،36، وهو متاح بحرية ولكن لديه متطلبات محددة بطاقة الرسومات. باستخدام FluoRender ، يمكن للمرء تدوير البيانات المقدمة ثلاثية الأبعاد في أي محور ، وتصور مجموعة البيانات في 4D بمرور الوقت ، وتوليد cutaways في أي مستوى ، وحفظ التناوب والتصورات كفيلم أو سلسلة من الصور tif.
وفيما يتعلق بالتحليل الكمي، هناك العديد من الأسئلة التي يتعين الإجابة عليها. لقد قمنا بتطوير برامج داخلية لمساعدة أهدافنا المحددة الخاصة لفهم سلوكيات الخلية الكامنة وراء تكوين الكوب البصري. برنامجنا، LongTracker، يستخدم إشارة النووية كوكيل لموقف لتتبع الخلايا13. مع هذه البيانات، يمكننا تحديد متى وأين وكيف تتحرك الخلايا. مدى سرعة ومدى تحرك الخلايا؛ ومدى تكرار انقسام الخلايا. بالإضافة إلى برامجنا الخاصة، هناك العديد من الخيارات المتاحة تجاريا والمصناة خصيصا لتتبع الخلايا 4D. كما قمنا بتطوير برنامج LongAxis لتنفيذ تجزئة الخلية وتحديد شكل الخلية وتنظيمها داخل شبكية العين العصبية37. ومع ذلك، فإن مجموعات البيانات التي يتم إدخالها في LongAxis هي مداخن Z واحدة، يتم التقاطها بدقة عالية. كان التحدي المستمر هو توليد مجموعات بيانات الفاصل الزمني بدقة عالية بما يكفي بحيث يمكن تقسيم الخلايا بثقة واستقراء مورفولوجيا لها. بديل واحد هو الفسيفساء (متفرق) وضع العلامات باستخدام الفلوروفورية القابلة للعكس الضوئي مثل Kaede للتصور المباشر لشكل الخلية ، كما قمنا نحن وآخرون في العينالنامية 8،11،13. هذا يبسط مشكلة تقسيم الخلية ، ويمكن بسهولة تحديد شكل الخلية وحجمها من خلال تقديم ثلاثي الأبعاد في FluoRender.
تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول خصيصا لأغراضنا. خصوصية هذا البروتوكول يؤدي إلى عدة قيود: البروتوكول، كما هو مكتوب، ليست الأمثل لتصوير جوانب أخرى من تطور العين حمار وحشي (مثل تكوين الشبكية العصبي)، وهياكل العين الأخرى، ومراحل النمو الأخرى، أو المقصورات دون الخلوية الأخرى. تم تصميم اتجاه التضمين وسرعة التصوير والتسميات للسماح لنا بالإجابة على أسئلتنا البيولوجية. من أجل تصوير تكوين الشبكية العصبي ، على سبيل المثال ، قد لا يسمح التوجه الظهري للجنين كما هو موضح هنا بتصور ميزات محددة ذات أهمية ، وقد لا تكون سرعة التصوير مناسبة. ويمكن تكييف العديد من جوانب البروتوكول وتعديلها لتلبية مجموعة متنوعة من الاحتياجات، تبعا لمصالح وأهداف معينة. أولا، استخدام حقن الحمض النووي الريبي يجعل عملية وضع العلامات مرنة للغاية. يمكن استخدام تركيبات دمج البروتين الفلوري لتسمية الهياكل دون الخلوية ذات الاهتمام ، ويمكن تنوع كمية حقن الحمض النووي الريبي لتحسين وضع العلامات. استنادا إلى عملنا مع الفلوروفوري Kaede القابلة للعكس الضوئي، يبدو أن حقن الحمض النووي الريبي تدعم دفعة من الترجمة التي انتهت بمقدار 12 حصان11،13. مستويات عالية من التعبير عن البروتين الفلوري من حقن الحمض النووي الريبي يمكن مكافحة photobleaching، ولكن مثل هذا النهج لا يدعم التعبير المستمر عن التسمية الفلورية من الاهتمام. إذا كان التعبير المستدام ضروريا ، كما هو الحال عند تصوير الأجنة في مراحل لاحقة ، فإن الخطوط المعدلة وراثيا هي خيار ، وبناء خطوط جديدة في حمار وحشي هوواضح 24.
بعد ذلك، يمكن تكييف البروتوكول للمراحل اللاحقة من التطوير. لأن الصباغ قد يعوق التصوير في مراحل لاحقة، يمكن علاج الأجنة مع الفينيلثيوريا (PTU) لمنع تكوين الصباغ، أو يمكن استخدام المسوخ الوراثية لتخليق الصباغ. لمنع ارتعاش الجنين، يمكن إضافة tricaine إلى حلول تراكب وسائط الآغاروز والجنين، ويمكن تعديل النسبة المئوية للأغاروز حسب الضرورة. كما ينمو العين, قد يكون من الضروري تغيير اتجاه تصاعد; هنا، ونحن جبل الأجنة الظهرية، ولكن في مراحل لاحقة، قد يكون أكثر منطقية لجبل أفقيا أو الأمامي، اعتمادا على هيكل الفائدة. لأن عمليات مختلفة تحدث على نطاقات مختلفة المكانية والزمنية ، يمكن للمرء أيضا تحسين خطوة Z وخطوة الوقت من اكتساب الصورة. هذه الميزات يمكن حقا فقط أن تحدد تجريبيا لاحتياجات كل مختبر.
وأخيرا، تم تطوير هذا البروتوكول خصيصا لمجهر كونفوجكال المسح بالليزر، مع الأجنة جزءا لا يتجزأ من نسبة عالية نسبيا من الآغروز في مرحلة مبكرة من نمو العين. إذا كان أحد التصوير في أوقات مختلفة أو مواقع مختلفة أثناء تطوير العين، وهذا البروتوكول سوف تحتاج إلى تكييفها لعملية الاهتمام. العديد من نهج التصوير المختلفة ممكنة حاليا ، مع المزيد من التطوير من قبل المهندسين البصريين. كل نهج يجلب مجموعة خاصة به من التحديات، من طرق مختلفة لتضمين وتركيب الأجنة للتصوير، إلى أحجام الملفات المختلفة والأشكال. نحن نحدد الاعتبارات في المقدمة لتوجيه عملية التحسين ، حيث يتم موازنة الدقة المكانية والزمنية القصوى مع photobleaching ، والسمية الضوئية ، وأحجام الملفات الهائلة. نأمل أن تساعد هذه المبادئ العامة ، بالإضافة إلى المعلومات العملية المذكورة أعلاه ، الآخرين في إنشاء نهج التصوير الفاصل الزمني لدراسة العديد من الأسئلة المفتوحة في تطوير العين.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لأعضاء مختبر كوان السابقين والحاليين على العمل على نهج الفاصل الزمني ومناقشات هذا البروتوكول. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة (R01 EY025378 وR01 EY025780 إلى KMK؛ F31 EY030758 إلى SL; و T32 GM007464 إلى لجنة الهدنة العسكرية).
Delta TPG Dish 0.17mm clear | Bioptechs | 0420041500C | coverglass bottom for optical compatibility |
Disposable Pasteur Pipettes | VWR | 14672-608 | overall length 14.6 cm (53/4") |
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter | P-97 | |
Immersol W | Carl Zeiss Microscopy | 4449690000000 | immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence |
Microinjection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side. |
Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL |
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature. |
Nikon SMZ645 Stereo Microscope | Nikon | SMZ645 | used for injecting embryos (see Fig. 2B) |
NotI-HF enzyme | NEB | R3189S | comes with Gel Loading Dye, Purple (6X) |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | fine resolution, low melt agarose |
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 | Carl Zeiss Microscopy | 421867-9970-000 | |
Olympus SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX2-ZB16 | used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A) |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested |
Pico-liter Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold |
Pipette Pump Pipettor | SP Bel-Art | F37898 | fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying |
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | 1.0 x 0.78 mm |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml) |
RNase-free H2O | Invitrogen | AM9906 | DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers |
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9000-000 | |
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9030-000 | |
Zeiss LSM 880 with Airyscan | Carl Zeiss Microscopy | N/A | inverted Axio Observer microscope |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss |