Aislamiento e imágenes de lapso de tiempo de células mesenquimas palatinas embrionarias primarias de ratón para analizar los atributos del movimiento colectivo
Summary
Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento bidimensional (2D) y ensayos de reparación de heridas. También proporcionamos la metodología para el análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo para determinar la formación de flujo celular y la motilidad direccional.
Abstract
El desarrollo del paladar es un proceso dinámico, que implica el crecimiento vertical de estantes palatales bilaterales junto a la lengua seguido de elevación y fusión por encima de la lengua. Los defectos en este proceso conducen al paladar hendido, un defecto congénito común. Estudios recientes han demostrado que la elevación de la plataforma palatal implica un proceso de remodelación que transforma la orientación de la plataforma de una vertical a una horizontal. El papel de las células mesenquimales de la plataforma palatal en esta remodelación dinámica ha sido difícil de estudiar. El análisis cuantitativo basado en imágenes de lapso de tiempo se ha utilizado recientemente para mostrar que las células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón (MEPM) pueden autoorganizarse en un movimiento colectivo. Los análisis cuantitativos pudieron identificar diferencias en las células MEPM mutantes a partir de un modelo de ratón con defectos de elevación del paladar. Este artículo describe métodos para aislar y cultivar células MEPM de embriones E13.5, específicamente para imágenes de lapso de tiempo, y para determinar varios atributos celulares del movimiento colectivo, incluidas las medidas para la formación de corrientes, la alineación de la forma y la persistencia de la dirección. Postula que las células MEPM pueden servir como un modelo proxy para estudiar el papel del mesénquima de la plataforma palatina durante el proceso dinámico de elevación. Estos métodos cuantitativos permitirán a los investigadores en el campo craneofacial evaluar y comparar los atributos de movimiento colectivo en células de control y mutantes, lo que aumentará la comprensión de la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. Además, las células MEPM proporcionan un modelo de célula mesenquimal raro para la investigación del movimiento celular colectivo en general.
Introduction
El desarrollo del paladar se ha estudiado ampliamente ya que los defectos en la palatogénesis conducen al paladar hendido, un defecto congénito común que ocurre en casos aislados o como parte de cientos de síndromes1,2. El desarrollo del paladar embrionario es un proceso dinámico que implica el movimiento y la fusión del tejido embrionario. Este proceso se puede dividir en cuatro pasos principales: 1) inducción de estantes palatales, 2) crecimiento vertical de los estantes palatales junto a la lengua, 3) elevación de los estantes palatales por encima de la lengua, y 4) fusión de los estantes palatales en la línea media1,3,4. En las últimas décadas, se han identificado muchos mutantes de ratón que manifiestan paladar hendido5,6,7,8. La caracterización de estos modelos ha indicado defectos en los pasos de inducción, proliferación y fusión de la plataforma palatal; sin embargo, los defectos de elevación de la plataforma palatal han sido raros. Por lo tanto, comprender la dinámica de la elevación de la plataforma palatal es un área intrigante de investigación.
El análisis cuidadoso de algunos mutantes de ratón con defectos de elevación de la plataforma palatina ha llevado al modelo actual que muestra que la región muy anterior de la plataforma palatina parece voltearse hacia arriba, mientras que un movimiento vertical a horizontal o “remodelación” de las plataformas palatinas ocurre en las regiones medias a posteriores del paladar1,3,4, 9,10,11. El epitelio del borde medial de la plataforma palatal probablemente inicia la señalización requerida para esta remodelación, que luego es impulsada por el mesénquima de la plataforma palatina. Recientemente, muchos investigadores han identificado retraso en la elevación de la plataforma palatal en modelos de ratón que mostraron adherencias orales transitorias que involucran estantes palatales12,13. La remodelación mesenquimal implica la reorganización de las células para crear una protuberancia en la dirección horizontal, mientras que simultáneamente retrae el estante palatal en la dirección vertical9,10,14. Entre los diversos mecanismos propuestos para afectar la elevación de la plataforma palatina y la remodelación mesenquimal subyacente se encuentran la proliferación celular15,16,17,los gradientes quimiotácticos18y los componentes de la matriz extracelular19,20. Surgió una pregunta importante: ¿el retraso en la elevación de la plataforma palatal observado en ratones deficientes en Specc1ltambién se debe en parte a un defecto en la remodelación de la plataforma palatal, y podría este defecto de remodelación manifestarse en un defecto intrínseco en el comportamiento de las células PRIMARIAS de MEPM21?
Las células MEPM primarias se han utilizado en el campo craneofacial para muchos estudios que involucran la expresióngénica 22,23, 24,25,26,27,28,29,y algunos que involucran proliferación30,31 y migración25,31,32 , pero ninguno para el análisis colectivo del comportamiento celular. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo de células MEPM en cultivo 2D y ensayos de reparación de heridas para mostrar que las células MEPM mostraban movimiento direccional y formaban corrientes celulares dependientes de la densidad-atributos del movimiento colectivo21. Además, las células mutantes specc1l formaron flujos celulares más estrechos y mostraron trayectorias de migración celular muy variables. Se considera que esta falta de motilidad coordinada contribuye al retraso de la elevación del paladar en embriones mutantes Specc1l 13,21. Por lo tanto, estos ensayos relativamente simples que utilizan células MEPM primarias pueden servir como un proxy para estudiar la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de células MEPM primarias, así como las imágenes y análisis de lapso de tiempo, para los ensayos 2D y de reparación de heridas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La elevación de la plataforma palatal constituye un evento de remodelación vertical a horizontal1,3,4,9,11. Se postula que este proceso de remodelación requiere que las células mesenquimales de la plataforma palatal se comporten coordinadamente. Los análisis con células MEPM de tipo salvaje muestran que este comportamiento celular es intrínseco y puede …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado en parte por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DE026172 (I.S.) y GM102801 (A.C.). I.S. también fue apoyado en parte por la subvención del Centro de Excelencia en Investigación Biomédica (COBRE) (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20 GM104936), la subvención de la Red IDeA de Kansas para la Excelencia en Investigación Biomédica (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20 GM103418) y la subvención del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo intelectual y del desarrollo (KIDDRC) de Kansas (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
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