Изоляция и покадровая визуализация первичных клеток эмбриональной небной мезенхимы мыши для анализа коллективных атрибутов движения

Развитие неба было широко изучено, поскольку дефекты небного генеза приводят к расщелине неба – распространенному врожденном дефекту, который возникает в единичных случаях или как часть сотен синдромов^1,2. Развитие эмбрионального неба является динамическим процессом, который включает в себя движение и слияние эмбриональной ткани. Этот процесс можно разделить на четыре основных этапа: 1) индукция небных полок, 2) вертикальный рост небных полок рядом с языком, 3) возвышение небных полок над языком и 4) слияние небных полок на средней линии^1,3,4. За последние несколько десятилетий у многих мышиных мутантов были выявлены проявления расщелины неба^5,6,7,8. Характеристика этих моделей показала дефекты на этапах индукции, пролиферации и слияния небной полки; однако дефекты высоты небных шельфов были редкими. Таким образом, понимание динамики возвышения небного шельфа является интригующей областью исследований.

Тщательный анализ некоторых мышиных мутантов с дефектами высоты небной полки привел к текущей модели, показывающей, что сама передняя область небной полки, по-видимому, переворачивается вверх, в то время как вертикальное к горизонтальному движению или «ремоделирование» небных полок происходит в средней и задней областях неба^{1,3,4, 9,10,11}. Эпителий медиальной кромки небной полки, вероятно, инициирует передачу сигналов, необходимую для этого ремоделирования, которое затем приводится в действие мезенхимой небной полки. В последнее время многие исследователи выявили задержку подъема небной полки в мышиных моделях, которые показали преходящие пероральные спайки с участием небных полок^12,13. Мезенхимальное ремоделирование предполагает реорганизацию клеток для создания выпуклости в горизонтальном направлении, одновременно втягивая небную полку в вертикальном направлении^9,10,14. Среди нескольких механизмов, предложенных для воздействия на высоту небной полки и лежащее в основе мезенхимальное ремоделирование, – пролиферация клеток^15,16,17,хемотаксические градиенты¹⁸и компоненты внеклеточного матрикса^19,20. Возник важный вопрос: наблюдается ли задержка подъема небной полки у мышей с дефицитом Specc1l такжечастично из-за дефекта ремоделирования небной полки, и может ли этот дефект ремоделирования проявляться во внутреннем дефекте поведения первичных клеток MEPM^21?

Первичные клетки MEPM использовались в черепно-лицевой области для многих исследований, включающих экспрессию генов^{22,23,24,25,26,27,28,29,}и несколько, включающих пролиферацию^30,31 и миграцию^25,31,32 , но не для коллективного анализа поведения клеток. Покадровую визуализацию клеток MEPM проводили в 2D-культуре и раневосточных анализах, чтобы показать, что клетки MEPM демонстрируют направленное движение и формируют зависящие от плотности клеточные потоки-атрибуты коллективного движения^21. Кроме того, мутантные клетки Specc1l образовывали более узкие клеточные потоки и демонстрировали сильно изменчивые траектории миграции клеток. Считается, что это отсутствие скоординированной подвижности способствует задержке подъема неба у мутантных эмбрионов Specc1l ^13,21. Таким образом, эти относительно простые анализы с использованием первичных клеток MEPM могут служить прокси для изучения ремоделирования мезенхимальных веществ во время подъема небного шельфа. В этой статье описывается изоляция и культура первичных клеток MEPM, а также покадровая визуализация и анализ для 2D и ран-восстановительных анализов.