Isolamento e imaging time-lapse di cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo primarie per analizzare gli attributi del movimento collettivo
Summary
Presentiamo un protocollo per l’isolamento e la coltura di cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo per l’imaging time-lapse di test di crescita bidimensionale (2D) e di riparazione delle ferite. Forniamo anche la metodologia per l’analisi dei dati di imaging time-lapse per determinare la formazione del flusso cellulare e la motilità direzionale.
Abstract
Lo sviluppo del palato è un processo dinamico, che comporta la crescita verticale di ripiani palatali bilaterali accanto alla lingua seguita da elevazione e fusione sopra la lingua. I difetti in questo processo portano alla palatoschisi, un difetto di nascita comune. Recenti studi hanno dimostrato che l’elevazione della mensola palatale comporta un processo di rimodellamento che trasforma l’orientamento della mensola da uno verticale a uno orizzontale. Il ruolo delle cellule mesenchimali della mensola palatale in questo rimodellamento dinamico è stato difficile da studiare. L’analisi quantitativa basata sull’imaging time-lapse è stata recentemente utilizzata per dimostrare che le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo (MEPM) possono auto-organizzarsi in un movimento collettivo. Le analisi quantitative potrebbero identificare differenze nelle cellule MEPM mutanti da un modello murino con difetti di elevazione del palato. Questo documento descrive i metodi per isolare e colturare cellule MEPM da embrioni E13.5, in particolare per l’imaging time-lapse, e per determinare vari attributi cellulari del movimento collettivo, comprese le misure per la formazione del flusso, l’allineamento della forma e la persistenza della direzione. Ipotizza che le cellule MEPM possano servire come modello proxy per studiare il ruolo del mesenchima della mensola palatale durante il processo dinamico di elevazione. Questi metodi quantitativi consentiranno ai ricercatori nel campo craniofacciale di valutare e confrontare gli attributi di movimento collettivo nelle cellule di controllo e mutanti, il che aumenterà la comprensione del rimodellamento mesenchimale durante l’elevazione della mensola palatale. Inoltre, le cellule MEPM forniscono un raro modello cellulare mesenchimale per lo studio del movimento cellulare collettivo in generale.
Introduction
Lo sviluppo del palato è stato ampiamente studiato in quanto i difetti della palatogenesi portano alla palatoschisi, un difetto di nascita comune che si verifica in casi isolati o come parte di centinaia di sindromi1,2. Lo sviluppo del palato embrionale è un processo dinamico che coinvolge il movimento e la fusione del tessuto embrionale. Questo processo può essere suddiviso in quattro fasi principali: 1) induzione di ripiani palatali, 2) crescita verticale dei ripiani palatali accanto alla lingua, 3) elevazione dei ripiani palatali sopra la lingua e 4) fusione dei ripiani palatali alla linea mediana1,3,4. Negli ultimi decenni, sono stati identificati molti mutanti di topo che manifestano palatoschisi5,6,7,8. La caratterizzazione di questi modelli ha indicato difetti nelle fasi di induzione, proliferazione e fusione della mensola palatale; tuttavia, i difetti di elevazione della mensola palatale sono stati rari. Pertanto, comprendere le dinamiche dell’elevazione della mensola palatale è un’area di ricerca intrigante.
Un’attenta analisi di alcuni mutanti di topo con difetti di elevazione della mensola palatale ha portato al modello attuale che mostra che la regione molto anteriore della mensola palatale sembra capovolgersi, mentre un movimento da verticale a orizzontale o “rimodellamento” dei ripiani palatali si verifica nelle regioni medio-posteriori del palato1,3,4, 9,10,11. L’epitelio del bordo mediale della mensola palatale probabilmente avvia la segnalazione necessaria per questo rimodellamento, che viene quindi guidato dal mesenchima della mensola palatale. Recentemente, molti ricercatori hanno identificato il ritardo di elevazione della mensola palatale in modelli murini che hanno mostrato aderenze orali transitorie che coinvolgono scaffali palatali12,13. Il rimodellamento mesenchimale comporta la riorganizzazione delle cellule per creare un rigonfiamento in direzione orizzontale, mentre contemporaneamente ritrae la mensola palatale nella direzione verticale9,10,14. Tra i diversi meccanismi proposti per influenzare l’elevazione della mensola palatale e il rimodellamento mesenchimale sottostante ci sono la proliferazione cellulare15,16,17,i gradienti chemiotattici18e i componenti della matrice extracellulare19,20. È sorta una domanda importante: il ritardo di elevazione della mensola palatale osservato nei topi carenti di Specc1lè anche in parte dovuto a un difetto nel rimodellamento della mensola palatale, e questo difetto di rimodellamento potrebbe manifestarsi in un difetto intrinseco nel comportamento delle cellule MEPM primarie21?
Le cellule MEPM primarie sono state utilizzate in campo craniofacciale per molti studi che coinvolgono l’espressione genica22, 23,24,25, 26,27,28,29e alcuni che coinvolgono la proliferazione30,31 e la migrazione25,31,32 , ma nessuno per l’analisi collettiva del comportamento cellulare. L’imaging time-lapse delle cellule MEPM è stato eseguito in coltura 2D e saggi di riparazione delle ferite per dimostrare che le cellule MEPM mostravano movimento direzionale e formavano flussi cellulari dipendenti dalla densità-attributi del movimento collettivo21. Inoltre, le cellule mutanti Specc1l hanno formato flussi cellulari più stretti e hanno mostrato traiettorie di migrazione cellulare altamente variabili. Si ritiene che questa mancanza di motilità coordinata contribuisca al ritardo dell’elevazione del palato negli embrioni mutanti Specc1l 13,21. Pertanto, questi saggi relativamente semplici che utilizzano cellule MEPM primarie possono servire come proxy per studiare il rimodellamento mesenchimale durante l’elevazione della piattaforma palatale. Questo documento descrive l’isolamento e la coltura delle cellule MEPM primarie, nonché l’imaging e l’analisi time-lapse, per i test 2D e di riparazione delle ferite.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’elevazione della mensola palatale costituisce un evento di rimodellamento da verticale a orizzontale1,3,4,9,11. Si ipotizza che questo processo di rimodellamento richieda che le cellule mesenchimali della mensola palatale si comportino in modo coordinato. Le analisi con cellule MEPM wildtype mostrano che questo comportamento cellulare è intrinseco e può es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health DE026172 (I.S.) e GM102801 (A.C.). I.S. è stato anche sostenuto in parte dalla sovvenzione del Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), dalla sovvenzione Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) e dalla sovvenzione del Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
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