בידוד והדמיה בזמן-לשגות של תאי מזנשים הפליאטל העוברי הראשי של העכבר כדי לנתח תכונות תנועה קולקטיבית
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של תאים מזנכימליים הפליאטוניים של עכבר ראשוניים להדמיה של צמיחה דו-ממדית (2D) ובגידות לתיקון פצעים. אנו מספקים גם את המתודולוגיה לניתוח נתוני ההדמיה של זמן לשגות כדי לקבוע היווצרות זרם תאים תנועתיות כיוונית.
Abstract
פיתוח החיך הוא תהליך דינמי, הכולל צמיחה אנכית של מדפי חיך דו-צדדיים ליד הלשון ואחריו גובה והיתוך מעל הלשון. פגמים בתהליך זה מובילים לחיך שסוע, מום מולד נפוץ. מחקרים אחרונים הראו כי גובה מדף פלטלי כרוך בתהליך שיפוץ שהופך את כיוון המדף מאנכי לאופקי. קשה ללמוד את תפקידם של תאי המדף המנשימליים בשיפוץ דינמי זה. ניתוח כמותי מבוסס הדמיה בזמן שימש לאחרונה כדי להראות כי תאי מזנכימלים הפליאטוניים עכבר ראשוניים (MEPM) יכולים לארגן את עצמם לתנועה קולקטיבית. ניתוחים כמותיים יכולים לזהות הבדלים בתאי MEPM מוטנטיים ממודל עכבר עם פגמים בגובה החיך. מאמר זה מתאר שיטות לבודד ולתרבות תאי MEPM מעוברי E13.5 – במיוחד להדמיה בזמן-לשגות- ולקבוע תכונות תאיות שונות של תנועה קולקטיבית, כולל אמצעים להיווצרות זרם, יישור צורה והתמדה של כיוון. הוא מניח שתאי MEPM יכולים לשמש מודל פרוקסי לחקר תפקידו של mesenchyme מדף פלטלי במהלך התהליך הדינמי של גובה. שיטות כמותיות אלה יאפשרו לחוקרים בתחום הקרניופאציה להעריך ולהשוות תכונות תנועה קולקטיבית בתאי שליטה ומוטנטים, אשר יגבירו את ההבנה של שיפוץ mesenchymal במהלך העלאת מדף פלטאלי. יתר על כן, תאי MEPM מספקים מודל תאים מזנכימלי נדיר לחקירה של תנועת תאים קולקטיבית באופן כללי.
Introduction
התפתחות החיך נחקרה בהרחבה כמו פגמים ב palatogenesis להוביל חיך שסוע – פגם מולד נפוץ המתרחש במקרים בודדים או כחלק ממאות תסמונות1,2. התפתחות החיך העוברי היא תהליך דינמי הכולל תנועה והיתוך של רקמה עוברית. תהליך זה ניתן לחלק לארבעה שלבים עיקריים: 1) אינדוקציה של מדפים palatal, 2) צמיחה אנכית של המדפים palatal ליד הלשון, 3) העלאת המדפים palatal מעל הלשון, ו 4) היתוך של המדפים palatal בקו האמצע1,3,4. במהלך העשורים האחרונים, מוטציות עכבר רבות זוהו כי לחיך שסוע גלוי5,6,7,8. אפיון מודלים אלה הצביע על פגמים באינדוקציה מדף palatal, התפשטות, וצעדי היתוך; עם זאת, פגמים בגובה מדף פלטלי היו נדירים. לכן, הבנת הדינמיקה של גובה מדף פלטלי הוא תחום מסקרן של מחקר.
ניתוח זהיר של כמה מוטציות עכבר עם פגמים בגובה מדף פלטלי הוביל למודל הנוכחי מראה כי האזור הקדמי מאוד של המדף palatal נראה להתהפך, בעוד תנועה אנכית לאופקית או “שיפוץ” של המדפים palatal מתרחשת באמצע לאזורים האחוריים של החיך1,3,4, 9,10,11. האפיתל הקצה המדיאלי של המדף palatal סביר יוזם את האיתות הנדרש עבור שיפוץ זה, אשר מונע לאחר מכן על ידי mesenchyme מדף palatal. לאחרונה, חוקרים רבים זיהו עיכוב בגובה מדף פלטלי במודלים של עכברים שהראו הידבקויות אוראליות חולפות המערבות מדפי palatal12,13. השיפוץ mesenchymal כרוך ארגון מחדש של התאים כדי ליצור בליטה בכיוון האופקי, ובו זמנית לסגת מדף palatal בכיוון האנכי9,10,14. בין מספר מנגנונים המוצעים להשפיע על גובה המדף palatal ואת שיפוץ mesenchymal הבסיסי הם התפשטות תאים15,16,17, שיפועים כימיים18, ורכיבי מטריצה חוץ תאית19,20. שאלה חשובה התעוררה: האם עיכוב גובה המדף palatal נצפה Specc1l-עכברים לקויים גם בחלקו בשל פגם בשיפוץ מדף palatal, והאם פגם שיפוץ זה יכול להתבטא פגם מהותי בהתנהגות של תאי MEPM ראשוניים21?
תאי MEPM ראשוניים שימשו בתחום הקרניופאציאל עבור מחקרים רבים הכוללים ביטויגנים 22,23,24,25,26,27,28,29, וכמה מעורביםהתפשטות 30,31 ונדידה25,31,32 אך אף אחד לא עבור ניתוח התנהגות תא קולקטיבית., הדמיה בזמן-לשגות של תאי MEPM בוצעה בתרבית 2D ובתיקונים לפצעים כדי להראות שתאי MEPM הציגו תנועה כיוונית ויצרו זרמי תאים תלויי צפיפות- תכונות של תנועהקולקטיבית 21. יתר על כן, תאים מוטנטיים Specc1l יצרו זרמי תאים צרים יותר והראו מסלולי העברת תאים משתנים מאוד. חוסר תנועתיות מתואם זה נחשב לתרום לעיכוב גובה החיך בעוברים מוטנטי Specc1l 13,21. לפיכך, בדיקות פשוטות יחסית אלה באמצעות תאי MEPM ראשוניים עשוי לשמש פרוקסי לחקר שיפוץ mesenchymal במהלך העלאת מדף palatal. מאמר זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי MEPM ראשוניים, כמו גם את הדמיה וניתוח זמן לשגות, עבור 2D ופצע תיקון הבדיקות.
Protocol
Representative Results
Discussion
גובה מדף פלטאלי מהווה אירוע שיפוץ אנכי עד אופקי1,3,4,9,11. הוא להניח כי תהליך שיפוץ זה דורש תאים mesenchymal מדף palatal להתנהג בתיאום. הניתוחים עם תאי MEPM של סוג פראי מראים שהתנהגות תא זו היא מהותית וניתן הכמות שלה<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך בחלקו על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות DE026172 (I.S.) ו- GM102801 (A.C. I.S. נתמך גם בחלקו על ידי מענק המצוינות במחקר ביו-רפואי (COBRE) (המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית P20 GM104936), מענק מצוינות מחקר מחקרי ביו-רפואי של קנזס (המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית P20 GM103418), ומענק המרכז הלאומי למוגבלויות שכליות והתפתחותיות בקנזס (U54 יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
