Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren
Summary
We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.
Abstract
Ontwikkeling van het gehemelte is een dynamisch proces, waarbij verticale groei van bilaterale palatale planken naast de tong wordt gevolgd door verhoging en fusie boven de tong. Defecten in dit proces leiden tot gespleten gehemelte, een veel voorkomende aangeboren afwijking. Recente studies hebben aangetoond dat palatale plankverhoging een verbouwingsproces omvat dat de oriëntatie van de plank transformeert van een verticale naar een horizontale. De rol van de palatale plank mesenchymale cellen in deze dynamische remodellering is moeilijk te bestuderen. Time-lapse-imaging-gebaseerde kwantitatieve analyse is onlangs gebruikt om aan te tonen dat primaire muis embryonale palatale mesenchymale (MEPM) cellen zichzelf kunnen organiseren in een collectieve beweging. Kwantitatieve analyses konden verschillen in gemuteerde MEPM-cellen identificeren van een muismodel met gehemelte-elevatiedefecten. Dit artikel beschrijft methoden om MEPM-cellen van E13.5-embryo’s te isoleren en te kweken – specifiek voor time-lapse beeldvorming – en om verschillende cellulaire kenmerken van collectieve beweging te bepalen, waaronder metingen voor stroomvorming, vormuitlijning en persistentie van richting. Het stelt dat MEPM-cellen kunnen dienen als een proxymodel voor het bestuderen van de rol van palataal plankmesenchym tijdens het dynamische proces van elevatie. Deze kwantitatieve methoden zullen onderzoekers in het craniofaciale veld in staat stellen om collectieve bewegingsattributen in controle- en mutante cellen te beoordelen en te vergelijken, wat het begrip van mesenchymale remodellering tijdens palatale plankverhoging zal vergroten. Bovendien bieden MEPM-cellen een zeldzaam mesenchymaal celmodel voor onderzoek naar collectieve celbewegingen in het algemeen.
Introduction
De ontwikkeling van het gehemelte is uitgebreid bestudeerd omdat defecten in palatogenese leiden tot gespleten gehemelte – een veel voorkomende aangeboren afwijking die optreedt in geïsoleerde gevallen of als onderdeel van honderden syndromen1,2. De ontwikkeling van het embryonale gehemelte is een dynamisch proces dat beweging en fusie van embryonaal weefsel omvat. Dit proces kan worden onderverdeeld in vier belangrijke stappen: 1) inductie van palatale planken, 2) verticale groei van de palatale planken naast de tong, 3) verhoging van de palatale planken boven de tong en 4) fusie van de palatale planken op de middellijn1,3,4. In de afgelopen decennia zijn veel muismutanten geïdentificeerd die een gespleten gehemelte manifesteren5,6,7,8. Karakterisering van deze modellen heeft defecten in palatale plankinductie, proliferatie en fusiestappen aangegeven; palatale plankverhogingsdefecten zijn echter zeldzaam. Het begrijpen van de dynamiek van palatale plankverhoging is dus een intrigerend onderzoeksgebied.
Zorgvuldige analyse van sommige muismutanten met palatale plankverhogingsdefecten heeft geleid tot het huidige model waaruit blijkt dat het voorste gebied van de palatale plank omhoog lijkt te klappen, terwijl een verticale naar horizontale beweging of “remodellering” van de palatale planken plaatsvindt in het midden tot achterste gebieden van het gehemelte1,3,4, 9,10,11. Het mediale randepitheel van de palatale plank initieert waarschijnlijk de signalering die nodig is voor deze remodellering, die vervolgens wordt aangedreven door het mesenchym van de palatale plank. Onlangs hebben veel onderzoekers palatale plankverhogingsvertraging geïdentificeerd in muismodellen die voorbijgaande orale verklevingen vertoonden met betrekking tot palataleplanken 12,13. De mesenchymale remodellering omvat reorganisatie van de cellen om een uitstulping in horizontale richting te creëren, terwijl tegelijkertijd de palatale plank in de verticale richting9,10,14wordt ingetrokken. Onder de verschillende mechanismen die worden voorgesteld om de palatale schapverhoging en de onderliggende mesenchymale remodellering tebeïnvloeden,zijn celproliferatie15,16, 17,chemotactische gradiënten18en extracellulaire matrixcomponenten19,20. Een belangrijke vraag rees: is de palatale plankverhogingsvertraging die wordt waargenomen bij Specc1l-deficiënte muizen ook gedeeltelijk te wijten aan een defect in de palatale plankremodellering, en zou dit remodelleringsdefect zich kunnen manifesteren in een intrinsiek defect in het gedrag van primaire MEPM-cellen21?
Primaire MEPM-cellen zijn gebruikt in het craniofaciale veld voor vele studies met genexpressie22,23,24,25,26,27,28,29,en een paar met proliferatie30,31 en migratie25,31,32 , maar geen voor collectieve celgedragsanalyse. Time-lapse beeldvorming van MEPM-cellen werd uitgevoerd in 2D-cultuur en wondhersteltests om aan te tonen dat MEPM-cellen directionele beweging vertoonden en dichtheidsafhankelijke celstromen-attributen van collectieve beweging vormden21. Bovendien vormden Specc1l-mutante cellen smallere celstromen en vertoonden ze zeer variabele celmigratietrajecten. Dit gebrek aan gecoördineerde beweeglijkheid wordt geacht bij te dragen aan de vertraging van de verhoging van het gehemelte in Specc1l mutante embryo’s13,21. Deze relatief eenvoudige testen met behulp van primaire MEPM-cellen kunnen dus dienen als een proxy voor het bestuderen van mesenchymale remodellering tijdens palatale plankverhoging. Dit artikel beschrijft de isolatie en cultuur van primaire MEPM-cellen, evenals de time-lapse beeldvorming en analyse, voor de 2D- en wondhersteltests.
Protocol
Representative Results
Discussion
Palatale plankverhoging vormt een verticale tot horizontale verbouwingsgebeurtenis1,3,4,9,11. Er wordt gepostuleerd dat dit remodelleringsproces vereist dat palatale plank mesenchymale cellen zich gecoördineerd gedragen. De analyses met wildtype MEPM-cellen tonen aan dat dit celgedrag intrinsiek is en gekwantificeerd kan worden21. Deze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies DE026172 (I.S.) en GM102801 (A.C.). I.S. werd ook gedeeltelijk ondersteund door de Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) -beurs (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) en Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) -beurs (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
