JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Kaynak Sınırlı Ortamlarda Gerçek Zamanlı İzotermal Nükleik Asit Amplifikasyon Reaksiyonlarını İzlemek için Açık Kaynaklı Minyatür Florometre

Published: February 03, 2021
doi:
10.3791/62148
, , , , , , ,
1Department of Bioengineering,Rice University

Summary

Gerçek zamanlı, nicel izotermal nükleik asit amplifikasyonu gerçekleştirmek için birçok düşük maliyetli ısıtıcı ile uyumlu açık kaynaklı, modüler bir florometre oluşturmak için ayrıntılı talimatlar sağlanmıştır.

Abstract

Nükleik asitleri tespit etmek ve ölçmek için geleneksel yöntemler polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanır ve ampliconların entegre floresan tespiti ile pahalı termosikler kullanılmasını gerektirir. İzotermal nükleik asit amplifikasyon teknolojileri termal bisiklet ihtiyacını ortadan kaldırır; bununla birlikte, gerçek zamanlı, nicel sonuçlar için ürünlerin floresan bazlı tespiti hala gereklidir. Entegre floresan algılamalı birkaç taşınabilir izotermal ısıtıcı artık ticari olarak mevcuttur; ancak, bu cihazların maliyeti, kaynak sınırlı ortamlarda yaygın olarak benimsenmesinin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan, raf dışı bileşenlerden üretilen modüler, düşük maliyetli bir florometrenin tasarımı ve montajı için bir protokoldür. Kompakt bir 3D baskılı muhafazaya yerleştirilmiş olan florometre, PCR tüpü tutan piyasada bulunan bir ısı bloğunun üzerine yerleştirilecek şekilde tasarlanmıştır. Burada açıklanan florometre floresan izotiyosiyanat (FITC) boyasını tespit etmek için optimize edilmiştir, ancak sistem gerçek zamanlı nükleik asit amplifikasyon reaksiyonlarında muhabir olarak yaygın olarak kullanılan boyalarla kullanılmak üzere değiştirilebilir. Sistemin klinik uygulanabilirliği, iki izotermal amplifikasyon teknolojisi ile gerçek zamanlı nükleik asit tespiti yapılarak gösterilmiştir: ticari bir kitte sağlanan pozitif kontrol DNA’sının tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve sars-CoV-2 RNA’nın klinik olarak anlamlı seviyelerinin tespiti için ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP).

Introduction

İszotermal amplifikasyon teknolojileri nükleik asitlerin tespiti için yaygın olarak kullanılmaktadır. Termosiklisleme gerektiren geleneksel PCR yaklaşımlarına kıyasla, izotermal amplifikasyon nükleik asit amplifikasyonunun tek bir sıcaklıkta gerçekleşmesini sağlar, böylece daha hızlı sonuç alma süresi ve inhibitörlerin daha iyi toleransını sağlar1,2. İzotermal amplifikasyonun bir diğer temel faydası da enstrümantasyon karmaşıklığının azalmasıdır. Çoğu izotermal amplifikasyon reaksiyonu sadece bir ısı bloğu ve algılama yöntemi gerektirir- floresan izleme veya uç nokta tespiti yoluyla gerçek zamanlı algılama, örneğin yanal akış veya jel elektroforezi3,4. Gerçek zamanlı floresan tespiti, çift iplikli DNA varlığında aktive olan boyaların veya belirli çift iplikli DNA dizilerinin varlığında aktive olan söndürülen floresan probların interkalasyon yoluyla üretilen floresan tespiti ile gerçekleştirilir.

Ticari olarak mevcut tezgah üstü izotermal florometreler mevcut olsa da, birçoğu tahlil uygulaması için özelleştirmeden yoksundur. Örneğin, birçok cihaz belirli veya şirket tarafından sağlanan sarf malzemeleri gerektirir, tercih edilen satıcıları önerir veya reklamı yapılan sonuçları elde etmek için özel mülk yazılım kullanır. Bu sistemlerin çoğu 5.000 ABD Dolarının üzerinde bir maliyete sahiptir ve bu da kaynak sınırlı ortamlarda yaygın kullanım için önemli bir engel teşkil eder. Buna ek olarak, düşük kaynak ayarlarındaki kullanıcılar, zorlu çevre koşulları, yedek parçalar için zayıf tedarik zincirleri ve bakım ve onarım için gerekli özel araçlar nedeniyle yüksek kaynak ayarları için tasarlanmış ekipmanı korumak için zorluklarla karşıkarşıyadır 5. Bu ihtiyacı karşılamak için, burada açıklanan, iki isteğe bağlı konfigürasyona sahip kompakt bir 3D baskılı gövdeye(Şekil 1A–C)eklenmiş raf dışı bileşenlerden üretilen modüler ve düşük maliyetli bir florometrenin tasarımı ve montajıdır. Bu cihazın ilk konfigürasyonu, aşırı arka plan ışığını engellemek için piyasada bulunan cam filtreler ve dikroik bir ayna kullanır ve toplam montaj maliyeti 830 USD’dir. Bu filtreler floresan bazlı görüntüleme sistemlerinde yaygın olarak kullanılırken, pahalı yüksek dereceli optik filtre folyolarının değiştirilmesinin daha önce nükleik asit tespitine izin verdiği gösterilmiştir6. Flormetrenin ikinci konfigürasyonu bu ucuz filtreleri içerir ve dikroik aynaları φ1/2″ ışın ayırıcılarla değiştirerek sistemin toplam maliyetini 830 $ ‘dan 450 USD’ye düşürür.

Montajın temsili görüntüleri Şekil 1 ve Şekil 2’deilk yapılandırma için gösterilir, ancak ikinci yapılandırma için benzer görüntüler Ek Dosya 6‘da bulunabilir. Özel optik hizalamaya ihtiyaç duymamak için optik sistem, her optik bileşeni yerleştirmek için belirlenmiş alanlara sahiptir ve nispeten düşük uçlu bir 3D yazıcı ile yapılabilir ve tasarımın yaygın olarak kullanılmasına izin verir. İki konfigürasyon için inşaat ve montajdaki tek fark, 3D baskı için kullanılan dosyalar ve kasaya yerleştirilen optik bileşenlerdir. Her iki sistem için 3D baskılı muhafazanın dış boyutları aynıdır. İki sistemin maliyet karşılaştırması Tablo 1‘de gösterilmiştir.

Şekil 1A’dagösterildiği gibi, küçük bir form faktörünü korumak için florometre, PCR tüpünün üstünden sinyali ölçmek için yerleştirilen kompakt aydınlatma ve algılama ile birleştiğinde Φ1/2″ (~12,5 mm) optikten oluşur. Şekil 1’deki sistem, FITC ve SYBR ve SYTO-9 gibi yakın ilişkili boyalar da dahil olmak üzere sırasıyla 490 nm ve 525 nm’ye yakın tepe ekscitasyon ve emisyon dalga boylarına sahip boyaları tespit etmek için tasarlanmıştır, bunlar genellikle gerçek zamanlı nükleik asit amplifikasyon reaksiyonlarında muhabir olarak kullanılır7,8. Heyecan kaynağı, optik filtreler ve dedektör, farklı floresan boyalarla uyumlu bileşenler için kolayca değiştirilebilir. Nükleik asit amplifikasyon reaksiyonları tipik olarak PCR tüplerinde gerçekleştirilir ve florometre, izotermal reaksiyonların gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan PCR tüplerini (Şekil 1D)tutan ticari olarak mevcut herhangi bir ısı bloğunun üzerine yerleştirilmek üzere tasarlanmıştır. Uygun ısı blokları çoğu biyomedikal laboratuvarda mevcuttur ve 500 USD’den daha düşük bir fiyatla satın alınabilir.

Görüntüleme teknolojilerini kontrol etmek için düşük maliyetli, bakım noktası alternatifi sağlamak için tek kartlı bilgisayarların kullanımı daha önce gösterilmiştir9. Bu işi inşa ederek, bu protokolde, gerçek zamanlı veri günlüğünü ve bakım noktasında sonuçların görüntülenmesini kolaylaştırmak ve bir dizüstü bilgisayarın verileri işlemesi veya görselleştirmesi ihtiyacını ortadan kaldırmak için tek kartlı bilgisayar destekli bir grafik kullanıcı arayüzü (Şekil 1D)kullanılır. Floresan ölçümleri I2C protokolü ile ışık sensörlerinden mikrodenetleyiciye aktarıldı ve daha sonra seri iletişim yoluyla tek kartlı bilgisayarın kullanımına sunuldu. Aydınlatma ve veri aktarımı için elektrik bağlantıları, minyatürleştirilmiş ekmek tahtalarında basitleştirilmiş kablolama ve lehimleme yoluyla sağlanarak özel baskılı devre kartlarına (PCB) olan ihtiyaç karşılanmıştır. Florometreyi çalıştırmak için gereken yazılım açık kaynaklı yazılım çerçeveleri aracılığıyla kullanılabilir ve cihazı çalıştırmak için gereken kod ek kodlama dosyalarındasağlanır. Komple florometre 450 ila 830 USD arasında bir araya getirilebilir ve sonuçlar, nükleik asitlerin gerçek zamanlı izotermal amplifikasyonlarını izlemek için doğru ve güvenilir floresan ölçümleri sağladığını göstermektedir.

Protocol

1. Hazırlık adımları: 3D baskı ve lehimleme NOT: Bu protokolde açıklanan optik sistem standart bir kuru blok ısıtıcı için tasarlanmıştır. İlk yapılandırmayı oluşturmak için, 3D sırasıyla Ek Dosyalar 1, 2 ve 3 olarak sağlanan CAD dosyalarını yazdırın: İkinci yapılandırmayı oluşturmak için, 3D sırasıyla Ek Dosyalar 3, 4 ve 5olarak sağlanan CAD dosyalarını yazdırın:NOT: Bu parçalar desteklerle yazdırılacak şekilde tasarlanmıştır. Bu kılavuzda, 110 ° C’ye kadar sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra formunu koruyabilen siyah bir polikarbonat filament kullanılır. Genel olarak, önemli bir deformasyon olmadan istenen izotermal reaksiyonun sıcaklığına ısıtılabilen herhangi bir malzeme kullanılabilir. İç yansımaların ve ortam ışığı parazitinin etkisini en aza indirmek için siyah veya başka bir koyu renkte bir malzeme önerilir. İki numunenin paralel izlenmesi için iki ışıktan dijitale sensör değerlendirme modüllerini hazırlayın. Sensör test panolarından birinde, R4 direncini çıkarın ve PCB’deki R4 alanının sağ pedinden PCB’deki R1 alanındaki üst pedine bir jumper teli lehimleyin. Bu, sensörün I2C adresini değiştirecek ve böylece her iki sensörün de aynı anda ölçülecek.NOT: Kullanılan sensör iki PCB’den oluşur: bir USB adaptör kartı ve ışık sensörünü içeren bir sensör test kartı; bu cihaz için sadece sensör test kartı gereklidir. İki Işık Yayan Diyot’un (LED) her birine lehim telleri. LED’de “1” etiketli ped için kırmızı bir tel (pozitif) ve LED’de “2” etiketli ped üzerinde siyah bir tel (negatif) bağlayın. LED’in arkasına ince bir termal yapıştırıcı tabakası uygulayın, LED’i bir uç kapağın üstüne yerleştirin ve termal yapıştırıcı kürleyene kadar bekleyin. Uç kapağın diğer tarafına bir ısı emici ekleyin.NOT: LED’leri muhafazaya kapatılmadan önce test ederken, uygun bir mavi ışık engelleyici göz koruması taktığından emin olun. İkinci konfigürasyonu oluşturmak için, mavi bir heyecan folyo levhadan iki adet 1/4 inç çapında daire ve makas veya jiletle sarı emisyon folyo levhadan dört adet 1/4 inç çapında daire kesin. ‘LCD_Screen_Holder.stl’ kısmının eğimli kısmındaki dört deliğin her birine M2.5 onaltılık şekilli bir kesici uç basın. 2. Optik montaj ‘Optics_Enclosure_Bottom.stl’ kısmının üstündeki deliğe 3/16 inç uzunluğunda 4-40 dişli bir kesici uç yerleştirin. Şekil 2A’dagösterildiği gibi 3D baskılı parçanın diğer tüm deliklerine 1/4 inç uzunluğunda 4-40 dişli bir kesici uç yerleştirin. Sensör test tahtasını, beş pim cihazın orta eksenine en yakın ve üstüne bakacak şekilde muhafazanın üst boşluğuna yerleştirin. Sensör test kartındaki delikten 3/16 inç uzunluğunda 4-40 vida ile emniyete alın(Şekil 2B). 20 mm odak uzaklığı lenslerinden birini sensör test panosunun altındaki bölüme dışbükey tarafı cihazın altına bakacak şekilde ve test kartından uzağa yerleştirin (Şekil 2C). İlk konfigürasyonu oluşturmak için, uzun geçiş filtresini önceki adıma yerleştirilen 20 mm odak uzaklığı lensinin(Şekil 2D)altındaki bir sonraki bölüme yerleştirin. İkinci konfigürasyonu oluşturmak için lensin altındaki bölüme iki sarı emisyon filtresi folyosu yerleştirin. İlk yapılandırmayı oluşturmak için, dikroik aynayı, üretici tarafından belirtilen filtre yönünü gözlemlerken, encasement merkezinin yakınındaki köşegen bölüme yerleştirin (Şekil 2E). İkinci konfigürasyonu oluşturmak için kiriş ayırıcıyı çapraz bölüme yerleştirin. Işın ayırıcı için belirli bir yönlendirmeye gerek yoktur. İkinci bir 20 mm odak uzaklığı lensini dikroik aynanın (veya yapılandırmaya bağlı olarak ışın ayırıcının) altındaki bölüme, dışbükey tarafı cihazın üst kısmına doğru işaret edecek şekilde yerleştirin (Şekil 2F). İlk yapılandırmayı oluşturmak için, eksitasyon filtresini dikroik aynanın sağındaki bölüme yerleştirin ve okun dikroik aynaya işaret etmesini sağlayın (Şekil 2G). İkinci konfigürasyonu oluşturmak için, kiriş ayırıcının sağındaki bölüme bir mavi heyecan filtresi folyosu yerleştirin. 15 mm odak uzaklığı lensini, dışbükey tarafı dikroik aynaya bakacak şekilde eksitasyon filtresinin sağına yerleştirin (Şekil 2H). Led dikroik aynaya (veya konfigürasyona bağlı olarak ışın ayırıcıya) bakacak şekilde, baskının kalan bölümüne bir LED yerleştirin. LED’den gelen iki kablonun girintili kanallara yerleştirildiğinden emin olun, böylece baskı sıkıca kapanır. 3D baskılı parçanın diğer tarafı için 2.3-2.9 adımlarını yineleyin (Şekil 2I). Kaplamanın üst yarısının ekstrüde edilmiş kısımlarını, kaplamanın alt yarısının girintili oluklarına yerleştirerek baskının üstündeki boş tarafını optik bileşenlerle kapatın. Yazdırılan iki parçayı 3/8 inç uzunluğunda 4-40 vida ile birlikte sabitleyin (Şekil 2J).NOT: Yazdırılan iki parça tamamen kapalı değilse, başıboş heyecan ışığı optik muhafazadan kaçabilir. Uygun bir conta elde edilene kadar uygun mavi ışık engelleyici göz korumasının takıldığından emin olun. Fazla ışık kaçmayana kadar muhafazayı yeniden yapıştırın. 3. Elektronik ve dokunmatik ekran montajı İki mini ekmek tahtasını birbirine bağlayın ve ardından mikrodenetleyiciyi ekmek tahtalarından birine yerleştirin. Mikrodenetleyicinin microUSB bağlantı noktasının dışa dönük olduğundan emin olun. LED modülasyonunu bağlamak için, LED (+) sürücüsünün CTL pimini mikrodenetleyicinin dijital pimine ve LED sürücüsünün LED (-) pimini mikrodenetleyicinin GND pimine bağlayın. Ekmek tahtalarının arkadaki plastik kapakları çıkarın. Birleşik ekmek tahtalarını ‘LCD_Screen_Holder.stl’ baskılı parçanın arka kısmının içine takmak için ekmek tahtalarının yapışkan arkasını 3D baskılı kısma bastırın. Sıvı kristal ekran (LCD) ekran tutucuyu, bir inç uzunluğunda 4-40 vidalı bölüm 2’de monte edilmiş optik muhafazaya monte edilmiş ekmek tahtalarıyla sabitleyin. LED güç kaynağını bağlamak için, LED sürücüsünün LED (+) pimini ilk LED’in pozitif teli ile bağlayın. İlk LED’in negatif telini ekmek tahtasındaki ikinci LED’in pozitif teli ile bağlayın. İkinci LED’in negatif telini LED sürücüsünün LED (-) pimine bağlayın.NOT: Birinci veya ikinci LED’in sırası rasgeledir. LED sürücü güç kaynağını bağlamak için, 10 V güç kaynağının pozitif ve negatif kablolarını sırasıyla LED sürücüsünün VIN+ ve VIN pimlerine bağlayın. (İki pimli adaptöre bir varil jakı kullanıldı.) Sensör test kartı güç kaynağını ve veri aktarımını bağlayın. Sensör test kartında yalnızca dört pim kullanılır: SCK, SDA, VDUT ve GND. 4 pimli dişiden erkek jumper teli alın ve hafiften dijitale sensör test panolarındaki pimleri LCD Tutucu baskısının sağ üst kısmındaki boşluktan mini ekmek tahtasına bağlayın. Ekmek tahtasında, aşağıdakiler arasındaki bağlantıların yerinde olduğundan emin olun: mikrodenetleyicinin 3.3 V pini ve her iki test panosunun VDUT pimi; mikrodenetleyicinin GND pimi ve her iki test tahtasının GND pimi; mikrodenetleyicinin analog 4 (A4) pimi ve her iki test tahtasının SDA pimi; ve mikrodenetleyicinin analog 5 (A5) pimi ve her iki test tahtasının SCK pimi.NOT: Işık sensörleri için I2C iletişim kullanıldığından, her iki sensörün SCK ve SDA pimleri mikrodenetleyicinin aynı pimlerine yönlendirilebilir. Tek kartlı bilgisayarı dört M2,5 vida ile LCD Ekran tutucusuna sabitleyin. Tek kartlı bilgisayarın HDMI ve güç adaptörü bağlantı noktalarının yukarı doğru olduğundan ve tek kartlı bilgisayarın 3D baskılı parçaya ortaıldığından emin olun. Dokunmatik ekran talimatlarına göre dokunmatik ekranı tek kartlı bilgisayara bağlayın ve ardından tek kartlı bilgisayarın HDMI bağlantı noktasını dokunmatik ekranın HDMI bağlantı noktasına bağlayın. 4. Yazılım yükleme Ek Kodlama Dosyası 1’de sağlanan özel çizim “MiniFluorimeter_2Diode.ino”yu mikrodenetleyiciye yüklemek için web düzenleyicisini yükleyin ve kullanın. “ClosedCube OPT3002” kitaplığının Kitaplık Yöneticisi kullanılarak yüklendiğinden emin olun. değişken led_A_pin adım 3.3’te (Elektronik ve dokunmatik ekran montaj bölümü) kullanılan dijital pim sayısıyla değiştirin. Pozlama Süresi değişkeninin değerini değiştirerek floresan ölçümleri alırken LED’in açık olduğu milisaniye sayısını ayarlayın. Değişkenin değerini değiştirerek LED pozlamaları arasındaki milisaniye sayısını ayarlayın led_A_Interval. Pozlamalar sırasında LED’lerin parlaklığını ayarlamak için değişken led_Power sıfır ile bir arasında bir sayıya değiştirin. Sıfır maksimum parlaklık miktarını, bir parlaklık ise en düşük parlaklığı verir. 3,5 inç ekranla birlikte verilen üreticinin yönergelerini izleyerek ekranı dokunmatik ekran üzerinden kontrol etme özelliğini açın.NOT: İstenirse, 3,5 inç ekran dokunmatik ekran özellikleri olmayan bir monitör olarak kullanılabilir ve tek kartlı bilgisayarın kontrolü için tek kartlı bilgisayarın USB bağlantı noktalarına bir klavye ve fare takılabilir. “MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py” dosyasını Ek Kodlama Dosyası 2’den tek kartlı bilgisayarda istediğiniz bir konuma indirin. Python’un çalışan bir sürümünün tek kartlı bilgisayara yüklendiğinden emin olun. Python 3.7 sağlanan Python modülünde kullanıldı, ancak sağlanan komut dosyasında uygun değişikliklerle herhangi bir kararlı Python sürümü kullanılabilir. Python programı için gereken kitaplıkları tek kartlı bilgisayara yükleyin. Değişken measurement_time ölçüm yapmak için istenen süreye değiştirin. Program, istenen süre geçtikten sonra alıma son eder ve kapanır. GUI ayrıca kullanıcı arabirimindeki bir düğme aracılığıyla edinmenin sona erdirilmesine izin verir. SerialPort değişkenini bağlı mikrodenetleyicinin seri adresiyle değiştirin. 5. Gerçek zamanlı floresan verilerinin kaydedilme Ticari ısı bloğunu açın ve istenen sıcaklığa ulaşmasını sağlar. Tek kartlı bilgisayarı, çoğu tek kartlı bilgisayar satın alımında sağlanan standart 5 V güç kaynağıyla güç sağlayın. Tek kartlı bilgisayarı mikroUSB -USB kablosuyla mikrodenetleyiciye bağlayın. Dokunmatik ekranı kullanarak, sağlanan Python komut dosyasını açın. measurement_time ve serialPort değişkenlerini istenen değerlerle değiştirin. outputFilepath değişkenini programın oluşturduğu veri dosyasının adıyla değiştirin. Dosya adının ‘.xlsx’ ile sona erdiğinden emin olun. Isı bloğuna izlenecek reaksiyonları içeren iki PCR tüpü yerleştirin. PCR tüplerinin yerleştirilmesinin, ısı bloğuna yerleştirildikten sonra florometrenin optik kanallarıyla hizalendiğinden emin olun. Florometreyi, flormetrenin her optik kanalından ekstrüde olan dört mandal arasında ortalanmış PCR tüpleri ile ısı bloğunun üzerine yerleştirin. Optimum ölçümler için, 3D baskılı florometrenin ısı bloğunun kuyularına güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Florometreyi güvenli bir şekilde takın, LED’ler için güç kaynağı adaptörünü takın. Python programını başlatmak için dokunmatik ekranı kullanın. LCD ekranda bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) görünür ve gerçek zamanlı floresanları ölçar. GUI’de kullanıcıya gösterilen her iki PCR tüpü için zaman içinde gerçek zamanlı floresan ölçümlerini gözlemleyin. Kullanıcı tarafından belirlenen deneme süresi geçtikten sonra edinme sona erer. Kullanıcı tanımlı konuma kaydedilen çıktı veri dosyasındaki ölçümleri görüntüleyin. Ölçümleri erken sonlandırmak için kullanıcı arabiriminde “Edinmeyi Durdur” etiketli düğmeye tıklayın.

Representative Results

Bir araya getirildikten sonra, florometre performansı fitc boya bir seyreltme serisinden floresan ölçülerek doğrulanabilir. Şekil 3A’da,florometrenin ilk konfigürasyonunun her iki kanalında da 1x PBS olarak hazırlanan 0, 20, 40, 60 ve 80 pg/μL konsantrasyonlarında FITC boya ölçümleri gösterilmiştir. Her örnek, 20 s aralıklarla 1,5 sn LED pozlaması ile üç kez ölçüldü. Florometrenin her iki kanalı da istenen aralıkta doğrusal bir yanıt gösterir. Florometrenin klinik uygulanabilirliği, sistemi iki izotermal amplifikasyon teknolojisiyle amplifikasyon yapmak için piyasada bulunan bir kuru ısı bloğu ile birlikte kullanarak daha da gösterilmiştir: RPA ve RT-LAMP. Şekil 3B, standart bir ticari kit içinde sağlanan ve üreticinin talimatlarına göre hazırlanan kit pozitif kontrol DNA’sı için 50 μL gerçek zamanlı RPA pozitif ve negatif kontrol reaksiyonlarının 39 °C amplifikasyonu sırasında ölçülen floresan temel olarak çıkarılan zaman seyrini göstermektedir. Nispeten düşük bir floresan seviyesi üreten RPA reaksiyonları, florometrenin ilk konfigürasyonu kullanılarak ölçüldü ve bu da heyecan verici ışığın daha iyi bastırılmasını sağlayan bir şey. Şekil 3C, Zhang ve ark. 10 ve Rabe veCepko11 tarafından açıklanan N2, E1 ve As1e astar setlerini kullanarak65°C’de özel bir RT-LAMP testinin zaman seyri ölçümünü göstermektedir. RT-LAMP reaksiyonları daha fazla miktarda floresan üretir ve ikinci, daha düşük maliyetli florometre konfigürasyonu kullanılarak ölçüldü. Oligonükleotidler 1 mM konsantrasyonda 2x TE tamponda satın alındı ve yeniden canlandırıldı. İleri iç astar (FIP) ve geri iç astar (BIP) oligoları yüksek performanslı sıvı kromatografisi saflaştırma ile sıralandı. Her astar seti (N2, E1 ve As1e) aşağıdaki gibi 25x karışımın 1000 μL’si yapmak için birleştirildi: 40 μL FIP, 40 μL BIP, 5 μL F3, 5 μL B3, 10 μL LF, 10 μL LB ve 890 μL 1x TE tampon. Her RT-LAMP reaksiyonunun montajı için, her astar setinin 1 μL’si 50x floresan boyanın 0,5 μL’sine ve 12,5 μL 2x ana karışıma eklendi ve reaksiyon hacmi üreticinin talimatlarına göre çekirdeksiz su ile 20 μL’ye kadar getirildi. SARS-CoV-2 RNA Kontrolü, çekirdeksiz suda seri olarak μL başına 10, 100 veya 1.000 kopya konsantrasyonlarına seyreltildi ve toplam 25 μL reaksiyon hacmi için 5 μL eklendi. Tüm deneylerde kullanılan hedef kontrolü (NTC) çekirdeksiz su değildi. RT-LAMP reaksiyonları 25 μL moleküler biyoloji sınıfı mineral yağ ile kaplandı. RPA ve RT-LAMP reaksiyonları 0,2 mL düşük profilli 8 tüplü PCR şeridinin iki kuyusunda monte edildi ve ultraclear düz kapaklarla kaplandı. Her RPA ve RT-LAMP reaksiyonı üç taraflı olarak çalıştırıldı. Tüm testlerde, mini florometre DNA amplifikasyonu ile ilişkili floresan seviyelerinin zamansal artışını başarıyla ölçtü. Şekil 1: Optik gövde ve ısı bloğunun üstünde monte edilmiş minyatür florometre. (A) Tek bir algılama kanalına yerleştirilen optik bileşenleri gösteren optik gövde şeması. (B) Montajdan sonra minyatür florometrenin ilk konfigürasyonunun şeması. (C) Tek bir algılama kanalına yerleştirilen optik bileşenlerle optik muhafazanın fotoğrafı. (D) Ticari olarak mevcut bir ısı bloğunun üzerine yerleştirilmiş monte edilmiş minyatür florometrenin fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Minyatür florometrenin montaj ve elektrik kontrol şeması. A-J) optik bileşenlerin ilk sistem yapılandırması için 3D baskılı optik gövdeye adım adım yerleştirilmesi. (K) Her iki konfigürasyon için minyatür florometrenin elektrik şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Minyatür florometre ile elde edilen temsili ölçümler. (A) Her iki kanalda da ölçülen floresan ve FITC boya konsantrasyonu istenen dinamik aralıkta doğrusal tepki gösterir. (B) Gerçek zamanlı floresan ve piyasada bulunan bir kitin pozitif ve negatif kontrollerinin izotermal amplifikasyonu için zaman. Amplifikasyon pozitif kontrol için beklendiği gibi gerçekleşir. (C) Gerçek zamanlı floresan ve SARS-CoV-2 RNA’nın 50.500 ve 5000 kopyalarının izotermal amplifikasyonu için zaman ve özel bir RT-LAMP testinden bir NTC örneği. Amplifikasyon, tahlil tespit sınırına yakın beklendiği gibi gerçekleşir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Sistem 1 Sistem 2 madde miktar Toplam Fiyat (USD) miktar Toplam Fiyat (USD) Optik Bileşenler Lens -ler 6 158.14 6 158.14 Ayna 2 244.56 2 60 Optik Filtreler 4 200 6 5 ara toplam 602.7 ara toplam 223.14 Aydınlatma ve Algılama Led 2 72.62 2 72.62 LED Sürücü 1 11.49 1 11.49 Fotodiyot 2 50 2 50 ara toplam 134.11 ara toplam 134.11 Elektronik ve Ekran Arduino Nano 1 20.7 1 20.7 Ahududu Pi 1 35 1 35 LCD Ekran 1 25 1 25 Mini Ekmek Tahtası 1 4 1 4 10V Güç Kaynağı 1 8.6 1 8.6 ara toplam 93.3 ara toplam 93.3 Toplam Maliyet (USD) 830.11 450.55 Tablo 1: Minyatür florometrenin iki konfigürasyonunun maliyet karşılaştırması. Ek Dosya 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl ve Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 3: LCD_Screen_Holder.stl Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Dosya 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl ve Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 6: System2_BuildInstructions.pdf Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Kodlama Dosyası 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Kodlama Dosyası 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan, izotermal amplifikasyon reaksiyonlarının nicel floresan tespiti için açık kaynaklı, düşük maliyetli, modüler, taşınabilir bir florometredir. Açık kaynaklı projeler, hazır yedek parçalarla hızlı ve ucuz bakım sağlar ve kullanıcılara sistemi modüler tasarıma göre ihtiyaçlarına göre uyarlama esnekliği sağlar. Bu protokol, mekanik, optik ve elektrik bileşenlerinin montajı ve optik performansın doğrulanarak gerçekleştirildi. Ayrıca, florometrenin RPA exo ve RT-LAMP olmak üzere önemli ölçüde farklı sıcaklık, hacim ve floresan gereksinimlerine sahip iki farklı tipte izotermal amplifikasyon testini izleme esnekliği gösterilmiştir. RPA, floresan üretimi için sıraya özgü FAM etiketli prob kullanan 50 μL reaksiyonlarda 39 °C’de, RT-LAMP ise 25 μL reaksiyon hacminde 65 °C’de gerçekleştirilir ve güçlendirilmiş DNA’nın varlığını bildirmek için bir intercalating boya kullanır. Floresan ölçümleri düz kapaklı PCR tüplerinin üstünden yapıldığından, florometre her iki test hacminden floresan tespit edebilir ve ısı gereksinimleri sadece seçilen ticari ısı bloğu ile sınırlıdır. Ayrıca, RT-LAMP’de üretilen floresan yoğunluğu, floresan sinyal üretiminin boyaya karşı prob tabanlı yöntemleri nedeniyle neredeyse RPA’da üretilenden daha büyük bir büyüklüktedir. Bununla birlikte, seçilen optik sensörün dinamik aralığı hem sinyalleri algılayabilir hem de ölçebilir ve temel çıkarma algoritmaları güvenilir floresan okumaları üretmek için bu farklılıkları hesaba katmaktadır.

Teknolojinin yayılmasını kolaylaştırmak ve potansiyel bakım maliyetini en aza indirmek için, farklı ortamlarda yaygın olarak bulunan ısıtıcılarla uyumlu modüler bir tasarım kullanılmıştır. Mevcut protokolde, ortak bir kuru blok ısıtıcı kullanıldı; aynı optik ve elektriksel tasarım, piyasada bulunan diğer ısıtıcılar için kolayca uyarlanabilir. Başka bir kuru blok ısıtıcı kullanılacaksa, 3D gövde tasarımında minimum değişiklik gerekecektir. Özellikle, optik muhafaza STL dosyalarının alt mandalları, diğer ticari ısı bloklarının kuyularıyla uygun hizalamayı sağlamak için değiştirilmelidir. Örneklerde gösterilen muhafazalar nispeten düşük uçlu bir 3D yazıcıya yazdırılırken (bkz. Malzeme Tablosu),yazıcı çözünürlüğünün ve/veya yazdırma toleranslarının optik bileşenlere ve dişli kesici uçlara uyum sağlamak için yeterli olduğundan emin olunmalıdır. Sağlanan STL dosyalarında, üretici firma tarafından belirtilen boyutlara göre radyal ve eksenel yönde optik bileşenlerin her iki tarafına 0,01-0,02 inç tolerans eklenmiştir. Bu, tüm optik bileşenlerin baskıya güvenli bir şekilde oturmasını ve kasanın fazla ışığın girmesini veya kaçmasını tamamen engellemesini sağlar. Dişli kesici uçlar için uygun bir pres sağlamak için, CAD dosyasındaki üretici tarafından sağlanan çaptan 0,01-0,02 inçlik benzer bir tolerans çıkarılır.

RPA reaksiyonları ilk florometre konfigürasyonu kullanılarak başarıyla izlenirken, RT-LAMP reaksiyonları her iki konfigürasyon kullanılarak da izlenebilir. RPA reaksiyonlarında florojenik prob tarafından üretilen düşük floresan seviyelerini izlemek için ilk konfigürasyonun geliştirilmiş başıboş ışık reddi gerekliydi. Buna karşılık RT-LAMP, sinyal üretimi için bir araya getiren bir boya kullanır ve bu da fotoğrafik filtre folyoları kullanarak ikinci konfigürasyonun alt dinamik aralığıyla uyumlu daha yüksek bir floresan yoğunluğu sağlar. Kullanıcılar, testlerinin element-intercalating boya veya florojenik prob üreten floresan sinyali ile eşleşen florometre konfigürasyonunu seçmelidir.

Bu sistemin bir sınırlaması, ısıtmanın standart bir duvar prizinden güç alan ticari olarak mevcut bir ısı bloğu tarafından sağlanmasıdır. Bu sistem, diğer gruplar tarafından gösterildiği gibi taşınabilir ve şarj edilebilir pil paketlerini dahil ederek elektriğe güvenilir erişimden yoksun alanlarda kullanılmak üzere daha da geliştirilebilir12. Diğer bir sınırlama, aynı anda sadece iki numunenin aynı anda floresan ölçümüne izin veren sistemin nispeten düşük verimidir. Kasanın birden fazla baskısı, verimi artırmak için aynı ısı bloğunun üzerine yerlenebilir; ancak, kullanılan ışık sensörü sadece dört benzersiz I2C adresine sahiptir. Bu, aynı anda dörtle ölçülebilen maksimum örnek sayısını kısıtlar. Verimi daha da artırmak için daha fazla sayıda benzersiz I2C adresine sahip farklı bir ışık sensörüne ihtiyaç vardır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Örnek hazırlama konusundaki yardımları için Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul ve Christopher Goh’a özel teşekkürler. Yazarlar caroline Noxon’a makale revizyonu için teşekkür eder. Bu çalışma için AMERIKAN halkından USAID tarafından IAVI ve USAID arasında AID-OAA-A16-00032 ödülü kapsamında CCID 9204 IAVI araştırma hibesi ile fon sağlanmıştır.

Materials

1/4-inch-long 4-40 threaded insert McMaster-Carr 90742A116 Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
10v power supply GlobTek, Inc. WR9HU1800CCP-F(R6B) AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W
15 mm focal length lens Thorlabs LA 1074 Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination.
1-inch-long 4-40 screws McMaster-Carr
20 mm focal length lens Thorlabs LA 1540 Four total are used for the fluorimeter.
2x WarmStart LAMP Master Mix New England Biolabs, Inc E1700 Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C
3.5” Touch Screen Uctronics BO10601
3/16-inch-long 4-40 screw McMaster-Carr 90128A105
3/16-inch-long 4-40 threaded insert McMaster-Carr 90742A115 Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure
3/8-inch-long 4-40 screws McMaster-Carr 90128A108 Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
3D printer filament 3D Universe UMNFC-PC285-BLACK Black or another dark color preferred
3D printer used Ultimaker Ultimaker 2+
8-tube PCR strips BioRad #TLS0801
Advanced Mini Dry Block Heater VWR International 10153-320 The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU
barrel jack to two-pin adapter SparkFun Electronics 1568-1238-ND
Blue Excitation Filter Foil LEE LE071S Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters.
Blue LED – 460 nm Mouser LZ1-30DB00-0100 Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
Dichroic Mirror Thorlabs DMLP505T Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
Emission Filter Edmunds Optics OG-515 Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source.
Excitation Filter Omega Filters 490AESP Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
LED Driver LEDdynamics 3021-D-I-700
M2.5 Hex Shaped insert McMaster-Carr 91292A009 Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder
Microcontroller Arduino Nano
Mini Breadboard Adafruit 65
Molecular biology-grade mineral oil Sigma Aldrich 69794
OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor Texas Instruments OPT3002EVM: Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. 
Purchased oligonucleotides Integrated DNA Technologies
RPA kit positive control DNA TwistDx Limited CONTROL01DNAE
SARS-CoV-2 RNA Control Twist Biosciences MN908947.3
Single board computer Raspberry Pi Raspberry Pi 3
TwistAmp RPA exo kit TwistDx Limited TAEXO02KIT
Ultraclear flat caps BioRad #TCS0803
Yellow Emmission Filter Foil LEE LE767S Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
  2. Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
  3. Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
  4. Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
  5. Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
  6. Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
  7. Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
  8. Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
  9. Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
  11. Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
  12. Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).

Tags

Keyword Extraction:Open-sourceMiniatureFluorimeterIsothermalNucleic Acid AmplificationResource-limited SettingsMolecular DiagnosticsIsothermal AmplificationOptics EnclosureTest BoardFocal Length LensLong Pass FilterEmission FilterDichroic MirrorBeam SplitterExcitation FilterLED

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Coole, J., Kortum, A., Tang, Y., Vohra, I., Maker, Y., Kundrod, K., Natoli, M., Richards-Kortum, R. Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings. J. Vis. Exp. (168), e62148, doi:10.3791/62148 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image