Fluorímetro miniatura de código abierto para monitorear las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos isotérmicos en tiempo real en entornos de recursos limitados
Summary
Se proporcionan instrucciones detalladas para construir un fluorímetro modular de código abierto que sea compatible con muchos calentadores de bajo costo para realizar la amplificación cuantitativa de ácidos nucleicos cuantitativos en tiempo real.
Abstract
Los métodos tradicionales para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y requieren el uso de termocicladores costosos con detección integrada de fluorescencia de amplicones. Las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos isotérmicos eliminan la necesidad de ciclos térmicos; sin embargo, la detección de productos basada en fluorescencia todavía es necesaria para obtener resultados cuantitativos en tiempo real. Varios calentadores isotérmicos portátiles con detección de fluorescencia integrada ahora están disponibles comercialmente; sin embargo, el costo de estos dispositivos sigue siendo una barrera significativa para la adopción generalizada en entornos de recursos limitados. Aquí se describe un protocolo para el diseño y ensamblaje de un fluorímetro modular de bajo costo construido a partir de componentes listos para usar. Encerrado en una carcasa compacta impresa en 3D, el fluorímetro está diseñado para colocarse encima de un bloque de calor disponible comercialmente que sostiene un tubo de PCR. El fluorímetro descrito aquí fue optimizado para detectar el tinte del isotiocianato de la fluoresceína (FITC), pero el sistema se puede modificar para el uso con los tintes usados comúnmente como reporteros en reacciones en tiempo real de la amplificación del ácido nucleico. La aplicabilidad clínica del sistema se demuestra mediante la realización de la detección de ácidos nucleicos en tiempo real con dos tecnologías de amplificación isotérmica: la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) para la detección de ADN de control positivo proporcionado en un kit comercial y la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) para la detección de niveles clínicamente significativos de ARN del SARS-CoV-2.
Introduction
Las tecnologías de amplificación isotérmica son ampliamente utilizadas para la detección de ácidos nucleicos. En comparación con los enfoques tradicionales de PCR que requieren termociclado, la amplificación isotérmica permite que la amplificación de ácidos nucleicos se produzca a una sola temperatura, lo que permite un tiempo de respuesta más rápido y una mejor tolerancia de los inhibidores1,2. Otro beneficio clave de la amplificación isotérmica es la reducción de la complejidad de la instrumentación. La mayoría de las reacciones de amplificación isotérmica sólo requieren un bloque de calor y una modalidad de detección, ya sea la detección en tiempo real a través de la monitorización de la fluorescencia o la detección de puntos finales, por ejemplo, por flujo lateral o electroforesis en gel3,4. La detección de fluorescencia en tiempo real se logra a través de la detección de fluorescencia producida por colorantes intercalantes que se activan en presencia de ADN de doble cadena o sondas fluorescentes apagadas que se activan en presencia de secuencias específicas de ADN de doble cadena.
Si bien existen fluorímetros isotérmicos de sobremesa disponibles en el comercio, muchos carecen de personalización para la implementación de ensayos. Por ejemplo, muchos dispositivos requieren consumibles específicos o proporcionados por la empresa, recomiendan proveedores preferidos o utilizan software propietario para obtener resultados anunciados. La mayoría de estos sistemas cuestan más de $5,000 USD, lo que representa una barrera significativa para el uso generalizado en entornos de recursos limitados. Además, los usuarios en entornos de bajos recursos se enfrentan a desafíos para mantener equipos diseñados para entornos de altos recursos debido a las duras condiciones ambientales, las cadenas de suministro débiles para las piezas de repuesto y las herramientas especializadas necesarias para el mantenimiento y la reparación5. Para satisfacer esta necesidad, aquí se describe el diseño y montaje de un fluorímetro modular y de bajo costo construido a partir de componentes listos para usar encerrados en una carcasa compacta impresa en 3D(Figuras 1A–C)con dos configuraciones opcionales. La primera configuración de este dispositivo utiliza filtros de vidrio disponibles comercialmente y un espejo dicroico para bloquear el exceso de luz de fondo y tiene un costo total de montaje de $ 830 USD. Si bien estos filtros se utilizan comúnmente en sistemas de imágenes basados en fluorescencia, la sustitución de costosas láminas de filtro óptico de alto grado se ha demostrado previamente que permite la detección de ácidos nucleicos6. La segunda configuración del fluorímetro incorpora estos filtros económicos y reemplaza los espejos dicroicos con divisores de haz de φ1/2″, reduciendo el costo total del sistema de $ 830 a $ 450 USD.
Las imágenes representativas del ensamblaje se muestran para la primera configuración en la Figura 1 y la Figura 2,pero las imágenes análogas para la segunda configuración se pueden encontrar en el Archivo Suplementario 6. Para evitar la necesidad de una alineación óptica especializada, el sistema óptico ha designado áreas para colocar cada componente óptico y se puede hacer con una impresora 3D de gama relativamente baja, lo que permite un uso generalizado del diseño. Las únicas diferencias en la construcción y el montaje para las dos configuraciones son los archivos utilizados para la impresión 3D y los componentes ópticos colocados en el gabinete. Las dimensiones externas de la carcasa impresa en 3D para ambos sistemas son las mismas. En el Cuadro 1se muestra una comparación de costes de los dos sistemas.
Como se muestra en la Figura 1A,para mantener un factor de forma pequeño, el fluorímetro consiste en ópticas de Φ1/2″ (~12,5 mm), junto con iluminación compacta y detección que se colocan para medir la señal a través de la parte superior del tubo de PCR. El sistema de la Figura 1 está diseñado para detectar colorantes con longitudes de onda de excitación y emisión máximas cercanas a 490 nm y 525 nm, respectivamente, incluyendo FITC y colorantes estrechamente relacionados como SYBR y SYTO-9, que se utilizan comúnmente como reporteros en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real7,8. La fuente de excitación, los filtros ópticos y el detector se pueden sustituir fácilmente por componentes compatibles con diferentes tintes fluorescentes según se desee. Las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos se realizan típicamente en tubos de PCR, y el fluorímetro está diseñado para colocarse encima de cualquier bloque de calor disponible comercialmente que contenga tubos de PCR(Figura 1D)lo que permite el monitoreo en tiempo real de las reacciones isotérmicas. Los bloques de calor apropiados están disponibles en la mayoría de los laboratorios biomédicos y se pueden comprar por menos de $ 500 USD.
El uso de computadoras de placa única para proporcionar una alternativa de bajo costo en el punto de atención para controlar las tecnologías de imágenes se ha demostradopreviamente 9. A partir de ese trabajo, en este protocolo se utiliza una interfaz gráfica de usuario alimentada por computadora de placa única(Figura 1D)para facilitar el registro de datos en tiempo real y la visualización de resultados en el punto de atención, eliminando la necesidad de que una computadora portátil procese o visualice datos. Las mediciones de fluorescencia se transfirieron a través del protocolo I2C de los sensores de luz a un microcontrolador, y luego se pusieron a disposición de la computadora de placa única a través de la comunicación en serie. Las conexiones eléctricas para la iluminación y la transferencia de datos se proporcionaron a través de cableado simplificado y soldadura en placas de pan miniaturizadas, negando la necesidad de placas de circuito impreso (PCB) especializadas. El software necesario para ejecutar el fluorímetro está disponible a través de marcos de software de código abierto y el código necesario para ejecutar el dispositivo se proporciona en los archivos de codificación suplementarios. El fluorímetro completo se puede ensamblar por entre $ 450 a $ 830 USD, y los resultados muestran que proporciona mediciones de fluorescencia precisas y confiables para monitorear la amplificación isotérmica en tiempo real de los ácidos nucleicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un fluorímetro de código abierto, de bajo costo, modular y portátil para la detección cuantitativa de fluorescencia de reacciones de amplificación isotérmica. Los proyectos de código abierto facilitan un mantenimiento rápido y económico con piezas de repuesto fácilmente disponibles y permiten a los usuarios la flexibilidad de adaptar el sistema a sus necesidades basándose en un diseño modular. Este protocolo describe el proceso de montaje de componentes mecánicos, ópticos y eléctricos, y la validación del rendimiento óptico. Además, se demostró la flexibilidad del fluorímetro para monitorear dos tipos diferentes de ensayos de amplificación isotérmica con requisitos de temperatura, volumen y fluorescencia significativamente diferentes, RPA exo y RT-LAMP. RPA se realiza a 39 °C en reacciones de 50 μL que utilizan una sonda etiquetada con FAM específica de la secuencia para la generación de fluorescencia, mientras que RT-LAMP se realiza a 65 °C en un volumen de reacción de 25 μL y utiliza un tinte intercalante para informar de la presencia del ADN amplificado. Debido a que las mediciones de fluorescencia se realizan a través de la parte superior de los tubos de PCR con tapas planas, el fluorímetro es capaz de detectar la fluorescencia de ambos volúmenes de ensayo, y los requisitos de calor solo están limitados por el bloque de calor comercial elegido. Además, la intensidad de fluorescencia producida en RT-LAMP es casi en el orden de magnitud mayor que la producida en RPA, debido a los métodos basados en colorante versus sonda de generación de señales de fluorescencia. Sin embargo, el rango dinámico del sensor óptico elegido puede detectar y cuantificar tanto las señales, y los algoritmos de resta de línea de base explican estas diferencias para producir lecturas de fluorescencia confiables.
Para facilitar la difusión de la tecnología y minimizar el costo potencial de mantenimiento, se empleó un diseño modular que es compatible con calentadores que están ampliamente disponibles en diferentes entornos. En el protocolo actual, un calentador común del bloque seco fue utilizado; el mismo diseño óptico y eléctrico se puede adaptar fácilmente para otros calentadores disponibles comercialmente. Si se va a utilizar otro calentador de bloque seco, se requerirán cambios mínimos en el diseño de la carcasa 3D. Específicamente, las clavijas inferiores de los archivos STL del gabinete óptico deben modificarse para garantizar una alineación adecuada con los pozos de otros bloques de calor comerciales. Si bien los gabinetes que se muestran en los ejemplos se imprimieron en una impresora 3D de gama relativamente baja (consulte la Tabla de materiales),se debe tener cuidado de garantizar que la resolución de la impresora y/o las tolerancias de impresión sean adecuadas para acomodar los componentes ópticos y las inserciones roscadas. En los archivos STL proporcionados, se agregó una tolerancia de 0.01-0.02 pulgadas a cada lado de los componentes ópticos en las direcciones radial y axial en función de las dimensiones especificadas por el fabricante. Esto garantiza que todos los componentes ópticos se ajusten de forma segura a la impresión y que el gabinete bloquee por completo el exceso de luz para que no entre o escape. Para garantizar un ajuste de prensa adecuado para las inserciones roscados, se restó una tolerancia similar de 0.01-0.02 pulgadas del diámetro proporcionado por el fabricante en el archivo CAD.
Las reacciones de RPA fueron supervisadas con éxito usando la primera configuración del fluorímetro, mientras que las reacciones de RT-LAMP se podían supervisar usando cualquier configuración. El rechazo mejorado de la luz perdida de la primera configuración era necesario supervisar los niveles bajos de la fluorescencia producidos por la punta de prueba fluorogenic en reacciones de RPA. En contraste, RT-LAMP utiliza un tinte intercalante para la generación de señales, lo que resulta en una mayor intensidad de fluorescencia que es compatible con el rango dinámico más bajo de la segunda configuración utilizando láminas de filtro fotográficas. Los usuarios deben seleccionar la configuración del fluorímetro que coincida con la señal de fluorescencia que genera el colorante intercalante de elementos o la sonda fluorógena de su ensayo.
Una limitación de este sistema es que la calefacción es proporcionada por un bloque de calor disponible comercialmente alimentado a través de una toma de corriente estándar. Este sistema podría seguir desarrollándose para su uso en zonas que carecen de acceso fiable a la electricidad mediante la incorporación de baterías portátiles y recargables, como muestran otros grupos12. Otra limitación es el rendimiento relativamente bajo del sistema, que permite la medición simultánea de fluorescencia de solo dos muestras a la vez. Se pueden colocar varias impresiones del gabinete encima del mismo bloque de calor para aumentar el rendimiento; sin embargo, el sensor de luz utilizado sólo tiene cuatro direcciones I2C únicas. Esto restringe el número máximo de muestras que se pueden medir simultáneamente a cuatro. Se necesita un sensor de luz diferente con un mayor número de direcciones I2C únicas para aumentar aún más el rendimiento.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un agradecimiento especial a Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul y Christopher Goh por su ayuda con la preparación de la muestra. Los autores agradecen a Caroline Noxon por la revisión del manuscrito. El financiamiento para este trabajo fue proporcionado por el pueblo estadounidense por USAID a través de una beca de investigación de IAVI CCID 9204 bajo el premio AID-OAA-A16-00032 entre IAVI y USAID.
Materials
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED – 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
References
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