Миниатюрный флуориметр с открытым исходным кодом для мониторинга реакций амплификации изотермических нуклеиновых кислот в режиме реального времени в условиях ограниченных ресурсов
Summary
Приведены подробные инструкции по созданию модульного флуориметра с открытым исходным кодом, совместимого со многими недорогими нагревателями для выполнения количественного усиления изотермических нуклеиновых кислот в режиме реального времени.
Abstract
Традиционные методы обнаружения и количественной оценки нуклеиновых кислот основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и требуют использования дорогостоящих термоциклеров с интегрированным флуоресцентным обнаружением ампликонов. Технологии амплификации изотермических нуклеиновых кислот устраняют необходимость в тепловом цикле; однако для получения количественных результатов в режиме реального времени по-прежнему требуется обнаружение продуктов на основе флуоресценции. В настоящее время коммерчески доступно несколько портативных изотермических нагревателей со встроенным флуоресцентным детектированием; однако стоимость этих устройств остается значительным препятствием для широкого внедрения в условиях ограниченных ресурсов. Здесь описан протокол для проектирования и сборки модульного, недорогого флуориметра, изготовленного из готовых компонентов. Флуориметр, заключенный в компактный корпус с 3D-печатью, предназначен для размещения на коммерчески доступном тепловом блоке, удерживаемом трубкой ПЦР. Описанный здесь флуориметр был оптимизирован для обнаружения красителя флуоресцеина изотиоцианата (FITC), но система может быть модифицирована для использования с красителями, обычно используемыми в качестве репортеров в реакциях амплификации нуклеиновых кислот в режиме реального времени. Клиническая применимость системы демонстрируется путем выполнения детектирования нуклеиновых кислот в режиме реального времени с помощью двух технологий изотермической амплификации: амплификации полимеразы рекомбиназы (RPA) для обнаружения положительной контрольной ДНК, предоставляемой в коммерческом наборе, и обратной транскрипционной петлево-опосредооцированной изотермической амплификации (RT-LAMP) для обнаружения клинически значимых уровней РНК SARS-CoV-2.
Introduction
Технологии изотермической амплификации широко используются для обнаружения нуклеиновых кислот. По сравнению с традиционными подходами ПЦР, которые требуют термоциклирования, изотермическая амплификация позволяет амплификации нуклеиновых кислот происходить при одной температуре, что позволяет ускорить время получения результатов и лучшую переносимость ингибиторов1,2. Еще одним ключевым преимуществом изотермического усиления является снижение сложности приборов. Большинство реакций изотермической амплификации требуют только теплового блока и метода обнаружения – либо обнаружения в режиме реального времени с помощью флуоресцентного мониторинга, либо обнаружения конечных точек, например, боковым потоком или гелевым электрофорезом3,4. Обнаружение флуоресценции в реальном времени осуществляется путем обнаружения флуоресценции, полученной путем интеркалирования красителей, которые активируются в присутствии двухцепочечной ДНК или закаленных флуоресцентных зондов, которые активируются в присутствии специфических двухцепочечных последовательностей ДНК.
В то время как коммерчески доступные настольные изотермические фториметры существуют, многим не хватает настройки для реализации анализа. Например, многие устройства требуют специальных или предоставленных компанией расходных материалов, рекомендуют предпочтительных поставщиков или используют проприетарное программное обеспечение для получения рекламируемых результатов. Большинство из этих систем стоят более 5000 долларов США, что представляет собой значительный барьер для широкого использования в условиях ограниченных ресурсов. Кроме того, пользователи в условиях ограниченных ресурсов сталкиваются с проблемами обслуживания оборудования, предназначенного для высокоресурсных условий из-за суровых условий окружающей среды, слабых цепочек поставок запасных частей и специализированных инструментов, необходимых для технического обслуживания и ремонта5. Для удовлетворения этой потребности здесь описана конструкция и сборка модульного и недорогого флуориметра, изготовленного из готовых компонентов, заключенных в компактный корпус с 3D-печатью(рисунки 1A–C)с двумя дополнительными конфигурациями. Первая конфигурация этого устройства использует коммерчески доступные стеклянные фильтры и дихроичное зеркало для блокировки избыточного фонового света и имеет общую стоимость сборки в размере 830 долларов США. Хотя эти фильтры обычно используются в системах визуализации на основе флуоресценции, ранее было показано, что замена дорогостоящих высококачественных оптических фильтрующих фольг позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты6. Вторая конфигурация флуориметра включает в себя эти недорогие фильтры и заменяет дихроичные зеркала на φ1/2″, снижая общую стоимость системы с 830 до 450 долларов США.
Репрезентативные изображения сборки показаны для первой конфигурации на рисунках 1 и 2,но аналогичные изображения для второй конфигурации можно найти в дополнительном файле 6. Чтобы избежать необходимости в специализированном оптическом выравнивании, оптическая система имеет выделенные области для размещения каждого оптического компонента и может быть изготовлена с помощью относительно недорогого 3D-принтера, что позволяет широко использовать конструкцию. Единственными различиями в конструкции и сборке для двух конфигураций являются файлы, используемые для 3D-печати, и оптические компоненты, размещенные в корпусе. Внешние размеры 3D-печатного корпуса для обеих систем одинаковы. Сравнение стоимости этих двух систем приведено в таблице 1.
Как показано на рисунке 1A,для поддержания малого форм-фактора флуориметр состоит из оптики Φ1/2″ (~12,5 мм) в сочетании с компактной подсветкой и детектированием, которые размещаются для измерения сигнала через верхнюю часть ПЦР-трубки. Система на фиг.1 предназначена для обнаружения красителей с пиковым возбуждением и длинами волн излучения около 490 нм и 525 нм соответственно, включая FITC и тесно связанные с ним красители, такие как SYBR и SYTO-9, которые обычно используются в качестве репортеров в реакциях амплификации нуклеиновых кислот в реальномвремени 7,8. Источник возбуждения, оптические фильтры и детектор могут быть легко заменены компонентами, совместимыми с различными флуоресцентными красителями по желанию. Реакции амплификации нуклеиновых кислот обычно выполняются в ПЦР-трубках, а флуориметр предназначен для размещения поверх любого коммерчески доступного теплового блока, который содержит трубкиПЦР (рисунок 1D),что позволяет осуществлять мониторинг изотермических реакций в режиме реального времени. Соответствующие тепловые блоки доступны в большинстве биомедицинских лабораторий и могут быть приобретены менее чем за 500 долларов США.
Использование одноплатных компьютеров для обеспечения недорогой альтернативы в месте оказания медицинской помощи для управления технологиями визуализации было ранее продемонстрировано9. Основываясь на этой работе, в этом протоколе используется одноплатный графический пользовательский интерфейс на базе компьютера(рисунок 1D)для облегчения регистрации данных в режиме реального времени и отображения результатов в месте оказания помощи, устраняя необходимость в том, чтобы портативный компьютер обрабатывал или визуализировал данные. Измерения флуоресценции передавались по протоколу I2C от датчиков освещенности к микроконтроллеру, а затем стали доступны для одноплатного компьютера через последовательную связь. Электрические соединения для освещения и передачи данных были обеспечены за счет упрощенной проводки и пайки на миниатюрных макетных платах, что сводило на нет необходимость в специализированных печатных платах (PCB). Программное обеспечение, необходимое для запуска флуориметра, доступно через программные платформы с открытым исходным кодом, а код, необходимый для запуска устройства, предоставляется в дополнительных файлах кодирования. Полный флуориметр может быть собран за сумму от 450 до 830 долларов США, и результаты показывают, что он обеспечивает точные и надежные измерения флуоресценции для мониторинга изотермического усиления нуклеиновых кислот в режиме реального времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описан недорогой модульный флуориметр с открытым исходным кодом для количественного флуоресцентного обнаружения реакций изотермической амплификации. Проекты с открытым исходным кодом облегчают быстрое и недорогое техническое обслуживание с помощью легкодоступных запасных частей и позволяют пользователям гибко адаптировать систему к своим потребностям на основе модульной конструкции. Этот протокол описывает процесс сборки механических, оптических и электрических компонентов и проверки оптических характеристик. Кроме того, была продемонстрирована гибкость флуориметра для мониторинга двух различных типов анализов изотермической амплификации со значительно отличающихся требованиями к температуре, объему и флуоресценции, RPA exo и RT-LAMP. RPA выполняют при 39 °C в реакциях 50 мкл, в которые используют специфический для последовательности FAM-помеченный зонд для генерации флуоресценции, в то время как RT-LAMP выполняется при 65 °C в реакционном объеме 25 мкл и использует интеркалирующий краситель для сообщения о присутствии амплифицированной ДНК. Поскольку измерения флуоресценции производятся через верхнюю часть ПЦР-трубок с плоскими колпачками, флуориметр способен обнаруживать флуоресценцию из обоих объемов анализа, а требования к теплу ограничены только выбранным коммерческим тепловым блоком. Кроме того, интенсивность флуоресценции, производимая в RT-LAMP, почти на порядок больше, чем в RPA, благодаря методам генерации флуоресцентного сигнала на основе красителя и зонда. Однако динамический диапазон выбранного оптического датчика может обнаруживать и количественно оценивать как сигналы, так и алгоритмы вычитания исходных условий учитывают эти различия для получения надежных показаний флуоресценции.
Для облегчения распространения технологий и минимизации потенциальных затрат на техническое обслуживание была использована модульная конструкция, совместимая с нагревателями, которые широко доступны в различных условиях. В действующем протоколе использовался обычный сухой блок нагреватель; такая же оптическая и электрическая конструкция может быть легко адаптирована для других коммерчески доступных нагревателей. Если будет использоваться еще один сухой блочный нагреватель, потребуются минимальные изменения в конструкции 3D-корпуса. В частности, нижние колышки файлов STL оптического корпуса должны быть изменены для обеспечения надлежащего выравнивания с скважинами других коммерческих тепловых блоков. Хотя корпуса, показанные в примерах, были напечатаны на относительно недорогом 3D-принтере (см. Таблицу материалов),следует позаботиться о том, чтобы разрешение принтера и/или допуски печати были адекватными для размещения оптических компонентов и резьбовых вставок. В предоставленных файлах STL допуск 0,01-0,02 дюйма был добавлен по обе стороны оптических компонентов в радиальном и осевом направлениях в зависимости от размеров, указанных производителем. Это гарантирует, что все оптические компоненты надежно помещаются в печать и что корпус полностью блокирует попадание или выход лишнего света. Чтобы обеспечить надлежащую посадку пресса для резьбовых вставок, аналогичный допуск 0,01-0,02 дюйма был вычтен из диаметра, предоставленного производителем в файле CAD.
Реакции RPA успешно контролировались с использованием первой конфигурации флуориметра, в то время как реакции RT-LAMP можно было контролировать с использованием любой конфигурации. Улучшенное отклонение рассеянного света первой конфигурации было необходимо для мониторинга низких уровней флуоресценции, производимой флуорогенной зондой в реакциях RPA. Напротив, RT-LAMP использует интеркалирующий краситель для генерации сигнала, что приводит к более высокой интенсивности флуоресценции, совместимой с более низким динамическим диапазоном второй конфигурации с использованием фотофильтрующей фольги. Пользователи должны выбрать конфигурацию флуориметра, которая соответствует флуоресцентным сигналу, генерирующему элемент-интеркалирующий краситель или флуорогенный зонд- их анализа.
Одним из ограничений этой системы является то, что отопление обеспечивается коммерчески доступным тепловым блоком, питаемым через стандартную настенную розетку. Эта система может быть дополнительно разработана для использования в районах, где отсутствует надежный доступ к электричеству, путем включения портативных и перезаряжаемых аккумуляторных батарей, как показано другими группами12. Другим ограничением является относительно низкая пропускная способность системы, которая позволяет одновременно измерять флуоресценцию только двух образцов одновременно. Несколько отпечатков корпуса могут быть размещены поверх одного и того же теплового блока для увеличения пропускной способности; однако используемый датчик освещенности имеет только четыре уникальных адреса I2C. Это ограничивает максимальное количество образцов, которые могут быть одновременно измерены, до четырех. Для дальнейшего увеличения пропускной способности необходим другой датчик освещенности с большим количеством уникальных адресов I2C.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Особая благодарность Челси Смит, Меган Чанг, Эмили Ньюшем, Саи Полу и Кристоферу Го за помощь в подготовке образцов. Авторы благодарят Кэролайн Ноксон за доработку рукописи. Финансирование этой работы было предоставлено американским народом USAID через исследовательский грант IAVI CCID 9204 в рамках премии AID-OAA-A16-00032 между IAVI и USAID.
Materials
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED – 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
References
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
