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Bioengineering

Fluorímetro em miniatura de código aberto para monitorar reações de amplificação de ácido nucleico isotérmico em tempo real em configurações limitadas de recursos

Published: February 03, 2021
doi:
10.3791/62148
, , , , , , ,
1Department of Bioengineering,Rice University

Summary

Instruções detalhadas são fornecidas para construir um fluorímetro modular de código aberto compatível com muitos aquecedores de baixo custo para realizar a amplificação de ácido nucleico isotérmico quantitativo em tempo real.

Abstract

Os métodos tradicionais para detectar e quantificar os ácidos nucleicos dependem da reação em cadeia de polimerase (PCR) e requerem o uso de termociclistas caros com detecção integrada de fluorescência de amplicons. As tecnologias isotermais de amplificação de ácido nucleico eliminam a necessidade de ciclismo térmico; no entanto, a detecção de produtos à base de fluorescência ainda é necessária para resultados quantitativos em tempo real. Vários aquecedores isthermais portáteis com detecção integrada de fluorescência estão agora disponíveis comercialmente; no entanto, o custo desses dispositivos continua a ser uma barreira significativa para a adoção generalizada em configurações limitadas a recursos. Descrito aqui é um protocolo para o projeto e montagem de um fluorímetro modular de baixo custo construído a partir de componentes fora da prateleira. Envolto em uma carcaça impressa 3D compacta, o fluorímetro foi projetado para ser colocado no topo de um bloco de calor comercialmente disponível segurando um tubo PCR. O fluorímetro descrito aqui foi otimizado para detectar corante de isocitonato de fluoresceína (FITC), mas o sistema pode ser modificado para uso com corantes comumente usados como repórteres em reações de amplificação de ácido nucleico em tempo real. A aplicabilidade clínica do sistema é demonstrada pela realização da detecção de ácido nucleico em tempo real com duas tecnologias de amplificação isotérmica: amplificação de polimerase recombinase (RPA) para detecção de DNA de controle positivo fornecido em um kit comercial e amplificação isotérmica mediada em loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para detecção de níveis clinicamente significativos de RNA SARS-CoV-2.

Introduction

As tecnologias de amplificação isotérmica são amplamente utilizadas para detecção de ácidos nucleicos. Em comparação com as abordagens tradicionais do PCR que requerem termociclismo, a amplificação isotérmica permite que a amplificação do ácido nucleico ocorra a uma única temperatura, permitindo assim um tempo mais rápido para resultados e melhor tolerância dos inibidores1,2. Outro benefício fundamental da amplificação isotemal é a redução da complexidade da instrumentação. A maioria das reações isotérmicas requerem apenas um bloqueio térmico e uma modalidade de detecção, seja detecção em tempo real através de monitoramento de fluorescência ou detecção de ponto final, por exemplo, por fluxo lateral ou eletroforese gel3,4. A detecção de fluorescência em tempo real é realizada através da detecção de fluorescência produzida por corantes intercalantes que se ativam na presença de DNA de dupla fita ou sondas fluorescentes saciadas que se ativam na presença de sequências específicas de DNA de dupla fita.

Embora existam fluoriímetros isotémicos disponíveis comercialmente, muitos não têm personalização para implementação de ensaios. Por exemplo, muitos dispositivos exigem consumíveis específicos ou fornecidos pela empresa, recomendam fornecedores preferenciais ou utilizam softwares proprietários para obter resultados anunciados. A maioria desses sistemas custa mais de US$ 5.000, representando uma barreira significativa para o uso generalizado em configurações limitadas a recursos. Além disso, os usuários em configurações de baixo recurso enfrentam desafios para manter equipamentos projetados para configurações de alto recurso devido a condições ambientais severas, cadeias de suprimentos fracas para peças de reposição e ferramentas especializadas necessárias para manutenção e reparo5. Para atender a essa necessidade, descrito aqui está o design e a montagem de um fluorímetro modular e de baixo custo construído a partir de componentes fora da prateleira incluídos em uma carcaça impressa 3D compacta(Figuras 1A–C) com duas configurações opcionais. A primeira configuração deste dispositivo usa filtros de vidro disponíveis comercialmente e um espelhodicróico para bloquear o excesso de luz de fundo e tem um custo total de montagem de US$ 830. Embora esses filtros sejam comumente usados em sistemas de imagem baseados em fluorescência, a substituição de folhas de filtro óptica de alto grau caras foi mostrada anteriormente para permitir a detecção de ácido nucleico6. A segunda configuração do fluorímetro incorpora esses filtros baratos e substitui os espelhosdicróicos por divisores de feixe de φ1/2″, reduzindo o custo total do sistema de US$ 830 para US$ 450.

Imagens representativas do conjunto são mostradas para a primeira configuração na Figura 1 e Figura 2,mas imagens análogas para a segunda configuração podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 6. Para evitar a necessidade de alinhamento óptico especializado, o sistema óptico designou áreas para colocar cada componente óptico e pode ser feito com uma impressora 3D relativamente low-end, permitindo o uso generalizado do design. As únicas diferenças na construção e montagem para as duas configurações são os arquivos usados para impressão 3D e os componentes ópticos colocados no gabinete. As dimensões externas do gabinete impresso em 3D para ambos os sistemas são as mesmas. Uma comparação de custos dos dois sistemas é mostrada na Tabela 1.

Como mostrado na Figura 1A, para manter um pequeno fator de forma, o fluorímetro consiste em óptica Φ1/2″ (~12,5 mm), juntamente com iluminação compacta e detecção que são colocadas para medir o sinal através da parte superior do tubo PCR. O sistema na Figura 1 foi projetado para detectar corantes com comprimentos de onda de pico e emissão perto de 490 nm e 525 nm, respectivamente, incluindo FITC e corantes intimamente relacionados, como SYBR e SYTO-9, que são comumente usados como repórteres em reações de amplificação de ácido nucleico em tempo real7,8. A fonte de excitação, os filtros ópticos e o detector podem ser prontamente substituídos por componentes compatíveis com diferentes corantes fluorescentes conforme desejado. As reações de amplificação de ácido nucleico são tipicamente realizadas em tubos PCR, e o fluorímetro foi projetado para ser colocado no topo de qualquer bloco de calor comercialmente disponível que mantenha tubos PCR(Figura 1D) permitindo o monitoramento em tempo real de reações isotermais. Os blocos de calor apropriados estão disponíveis na maioria dos laboratórios biomédicos e podem ser comprados por menos de US$ 500.

O uso de computadores de placa única para fornecer uma alternativa de ponto de cuidado de baixo custo para o controle de tecnologias de imagem foi previamente demonstrado9. Aproveitando esse trabalho, neste protocolo uma interface de usuário gráfica alimentada por computador de placa única (Figura 1D) é usada para facilitar o registro de dados em tempo real e a exibição de resultados no ponto de atendimento, eliminando a necessidade de um computador portátil processar ou visualizar dados. As medidas de fluorescência foram transferidas através do protocolo I2C dos sensores de luz para um microcontrolador, e depois disponibilizadas para o computador de placa única através da comunicação serial. As conexões elétricas para iluminação e transferência de dados foram fornecidas por meio de fiação simplificada e solda em pães miniaturizados, negando a necessidade de placas de circuito impresso (PCBs) especializadas. O software necessário para executar o fluorímetro está disponível através de estruturas de software de código aberto e o código necessário para executar o dispositivo é fornecido nos arquivos de codificação suplementar. O fluorímetro completo pode ser montado por entre US$ 450 e US$ 830, e os resultados mostram que ele fornece medições precisas e confiáveis de fluorescência para monitorar a amplificação isotérmica em tempo real de ácidos nucleicos.

Protocol

1. Etapas de preparação: impressão 3D e solda NOTA: O sistema óptico descrito neste protocolo foi projetado para um aquecedor de bloco seco padrão. Para criar a primeira configuração, imprima em 3D os arquivos CAD fornecidos como Arquivos Suplementares 1, 2 e 3, respectivamente: Para criar a segunda configuração, imprima em 3D os arquivos CAD fornecidos como Arquivos Suplementares 3, 4 e 5, respectivamente:NOTA: Estas peças foram projetadas para serem impressas com suportes. Neste guia, é utilizado um filamento de policarbonato preto que pode manter sua forma após ser submetido a temperaturas de até 110 °C. Em geral, qualquer material que possa ser aquecido à temperatura da reação isotemal desejada sem deformação significativa pode ser usado. Para minimizar o efeito de reflexões internas e interferência de luz ambiente, recomenda-se um material preto ou outra cor escura. Prepare os dois módulos de avaliação de sensores leves para digitais para monitoramento paralelo de duas amostras. Em uma das placas de teste do sensor, remova o resistor R4 e solde um fio de jumper da almofada direita da área R4 no PCB até a almofada superior na área R1 no PCB. Isso mudará o endereço I2C do sensor, permitindo assim a medição simultânea de ambos os sensores.NOTA: O sensor utilizado consiste em dois PCBs: uma placa adaptadora USB e uma placa de teste de sensor contendo o sensor de luz; apenas a placa de teste do sensor é necessária para este dispositivo. Fios de solda para cada um dos dois Diodos Emissores de Luz (LEDs). Conecte um fio vermelho (positivo) à almofada rotulada como “1” no LED e um fio preto (negativo) na almofada rotulada como “2” no LED. Aplique uma fina camada de adesivo térmico na parte de trás do LED, coloque o LED na parte superior de uma tampa final e espere até que o adesivo térmico cure. Do outro lado da tampa final, adicione uma dissipador de calor.NOTA: Ao testar os LEDs antes de serem selados no gabinete, certifique-se de usar uma proteção adequada para bloquear a luz azul. Para criar a segunda configuração, corte dois círculos de 1/4 polegada de diâmetro a partir de uma folha de papel alumínio azul e quatro círculos de 1/4 polegada de diâmetro de uma folha de papel alumínio amarela com tesoura ou uma lâmina de barbear. Pressione uma inserção em forma de hexeto M2.5 em cada um dos quatro orifícios na porção inclinada da parte ‘LCD_Screen_Holder.stl’. 2. Montagem óptica Coloque uma inserção roscada de 4-40 de 3/16 polegadas no orifício na parte superior da parte ‘Optics_Enclosure_Bottom.stl’. Coloque uma inserção roscada de 4-40 polegadas de comprimento em todos os outros orifícios da peça impressa 3D, conforme mostrado na Figura 2A. Insira a placa de teste do sensor na cavidade superior da carcaça, com os cinco pinos voltados para a parte superior e mais próximo do eixo central do dispositivo. Fixe com um parafuso 4-40 de 3/16 polegadas através do orifício na placa de teste do sensor(Figura 2B). Coloque uma das lentes de distância focal de 20 mm na seção abaixo da placa de teste do sensor com o lado convexo voltado para a parte inferior do dispositivo e longe da placa de teste(Figura 2C). Para criar a primeira configuração, coloque o filtro de passagem longa na próxima seção abaixo da lente de comprimento focal de20 mm (Figura 2D) colocada na etapa anterior. Para criar a segunda configuração, coloque duas folhas amarelas do filtro de emissão na seção abaixo da lente. Para criar a primeira configuração, coloque o espelho dicroico na seção diagonal próxima ao centro do encadeamento enquanto observa a orientação do filtro especificada pelo fabricante(Figura 2E). Para criar a segunda configuração, coloque o divisor de feixe na seção diagonal. Não é necessária uma orientação específica para o divisor de raios. Coloque uma segunda lente de distância focal de 20 mm na seção abaixo do espelhodicróico (ou divisor de feixe, dependendo da configuração) com o lado convexo apontando para a parte superior do dispositivo(Figura 2F). Para criar a primeira configuração, coloque o filtro de excitação na seção à direita do espelhodicróico, certificando-se de que a seta aponta para o espelho dicroico(Figura 2G). Para criar a segunda configuração, coloque uma folha azul do filtro de excitação na seção à direita do divisor de feixes. Coloque a lente de distância focal de 15 mm à direita do filtro de excitação com o lado convexo voltado para o espelhodicróico(Figura 2H). Coloque um LED na seção restante da impressão, com o LED voltado para o espelhodicróico (ou divisor de feixe, dependendo da configuração). Certifique-se de que os dois fios que levam do LED estão inseridos nos canais rebaixados para que a impressão feche firmemente. Repetir as etapas 2.3-2.9 para o outro lado da peça impressa 3D (Figura 2I). Feche o lado vazio da impressão na parte superior da impressão com os componentes ópticos colocando as porções extrudadas da metade superior do encosto nas ranhuras rebaixadas da metade inferior do encosto. Fixar as duas peças impressas juntamente com parafusos 4-40 de 3/8 polegadas de comprimento(Figura 2J).NOTA: Se as duas peças impressas não estiverem completamente fechadas, a luz de excitação perdida pode escapar da carcaça óptica. Certifique-se de que a proteção adequada do olho de bloqueio de luz azul seja usada até que uma vedação adequada seja alcançada. Recenda o gabinete até que não escapem o excesso de luz. 3. Montagem eletrônica e touchscreen Conecte as duas mini tábuas de pão e coloque o microcontrolador em uma das tábuas de pão. Certifique-se de que a porta microUSB do microcontrolador voltado para fora. Para conectar a modulação led, conecte o pino CTL do driver LED (+) a um pino digital do microcontrolador e do pino LED (-) do driver LED a um pino GND do microcontrolador. Remova as tampas de plástico na parte de trás das tábuas de pão. Pressione o apoio adesivo das tábuas de pão à peça impressa em 3D para fixar as tábuas combinadas no interior da parte traseira da peça impressa ‘LCD_Screen_Holder.stl’. Fixar o suporte de tela de cristal líquido (LCD) com as tábuas de pão montadas dentro do gabinete óptico montado na seção 2 com parafusos de 4 a 40 de comprimento. Para conectar a fonte de alimentação LED, conecte o pino LED (+) do driver LED ao fio positivo do primeiro LED. Conecte o fio negativo do primeiro LED ao fio positivo do segundo LED na prancha. Conecte o fio negativo do segundo LED ao pino LED (-) do driver LED.NOTA: A ordem do primeiro ou segundo LED é arbitrária. Para conectar a fonte de alimentação do driver LED, conecte os fios positivos e negativos da fonte de alimentação de 10 V aos pinos VIN+ e VIN do driver LED, respectivamente. (Foi usado um macaco de barril para adaptador de dois pinos.) Conecte a fonte de alimentação da placa de teste do sensor e a transferência de dados. Apenas quatro pinos na placa de teste do sensor são usados: o SCK, SDA, VDUT e GND. Pegue uma fêmea de 4 pinos para o fio de jumper masculino e conecte esses pinos nas placas de teste do sensor leve-digital à mini prancha através da abertura no canto superior direito da impressão DO Suporte LCD. Na prancha, certifique-se de que as conexões entre os seguintes estejam em vigor: o pino de 3,3 V do microcontrolador e o pino VDUT de ambas as placas de teste; o pino GND do microcontrolador e do pino GND de ambas as placas de teste; o pino analógico 4 (A4) do microcontrolador e o pino SDA de ambas as placas de teste; e o pino analógico 5 (A5) do microcontrolador e do pino SCK de ambas as placas de teste.NOTA: Como a comunicação I2C é usada para os sensores de luz, os pinos SCK e SDA de ambos os sensores podem ser encaminhados para os mesmos pinos do microcontrolador. Fixar o computador de placa única no suporte da tela LCD com quatro parafusos M2.5. Certifique-se de que as portas HDMI e adaptador de alimentação do computador de placa única encarem para cima e o computador de placa única esteja centrado na parte impressa em 3D. Conecte o display touchscreen ao computador de placa única de acordo com as instruções touchscreen e, em seguida, conecte a porta HDMI do computador de placa única à porta HDMI da tela sensível ao toque. 4. Instalação de software Instale e use o editor da Web para carregar o esboço personalizado “MiniFluorimeter_2Diode.ino” fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1 no microcontrolador. Certifique-se de que a biblioteca “ClosedCube OPT3002” esteja instalada usando o Gerenciador de Bibliotecas. Alterar a variável led_A_pin para o número do pino digital utilizado na etapa 3.3 (Seção eletrônica e montagem touchscreen). Ajuste o número de milissegundos que o LED é ligado ao adquirir medidas de fluorescência alterando o valor da variável ExposureTime. Ajuste o número de milissegundos entre as exposições de LED alterando o valor da variável led_A_Interval. Alterar a variável led_Power para um número entre zero e um para ajustar o brilho dos LEDs durante as exposições. Zero dá a quantidade máxima de brilho e dá a menor quantidade de brilho. Ligue a capacidade de controlar o display via tela sensível ao toque seguindo as instruções do fabricante fornecidas com a tela de 3,5 polegadas.NOTA: Se desejar, a tela de 3,5 polegadas pode ser usada como monitor sem recursos touchscreen, e um teclado e mouse podem ser conectados às portas USB do computador de placa única para controle do computador de placa única. Baixe o arquivo “MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py” do Arquivo de Codificação Suplementar 2 para um local desejado no computador de placa única. Certifique-se de que uma versão de trabalho do Python seja instalada no computador de placa única . Python 3.7 foi usado no módulo Python fornecido, mas qualquer versão Python estável poderia ser usada com alterações apropriadas no script fornecido. Instale as bibliotecas necessárias para o programa Python no computador de placa única. Alterar a variável measurement_time para o tempo desejado para fazer medições. O programa encerra a aquisição e fecha após o tempo desejado. A GUI também permite que a aquisição seja encerrada através de um botão na interface do usuário. Altere a variável serialPort para o endereço serial do microcontrolador conectado. 5. Registrando dados de fluorescência em tempo real Ligue o bloco de calor comercial e deixe-o atingir a temperatura desejada. Ligue o computador de placa única com uma fonte de alimentação padrão de 5 V fornecida com a maioria das compras de computador de placa única. Conecte o computador de placa única ao microcontrolador com um microUSB ao cabo USB. Usando a tela sensível ao toque, abra o script Python fornecido. Altere as variáveis measurement_time e serialPort para os valores desejados. Alterar a saída variávelFilepath para o nome do arquivo de dados que o programa gera. Certifique-se de que o nome do arquivo termine em ‘.xlsx’. Coloque dois tubos PCR contendo as reações a serem monitoradas no bloco de calor. Certifique-se de que a colocação dos tubos PCR se alinhe com os canais ópticos do fluorímetro uma vez que ele é colocado no bloco de calor. Coloque o fluorímetro sobre o bloco de calor com os tubos PCR centrados entre os quatro pinos extrudando de cada canal óptico do fluorímetro. Para as medidas ideais, certifique-se de que o fluorímetro impresso em 3D esteja preso firmemente nos poços do bloco de calor. Conecte com segurança o fluorímetro, conecte o adaptador de alimentação para os LEDs. Use a tela sensível ao toque para iniciar o programa Python. Uma interface gráfica de usuário (GUI) aparece na tela LCD e mede a fluorescência em tempo real. Observe as medidas de fluorescência em tempo real ao longo do tempo para ambos os tubos PCR que são mostrados ao usuário na GUI. Após o tempo de experiência determinado pelo usuário ter transcorrido, a aquisição cessa. Veja as medidas no arquivo de dados de saída salvo no local definido pelo usuário. Para finalizar as medições mais cedo, clique no botão rotulado “Stop Acquisition” na interface do usuário.

Representative Results

Uma vez montado, o desempenho do fluorímetro pode ser validado medindo fluorescência de uma série de diluição de corante FITC. Na Figura 3A, são mostradas medidas de corante FITC em concentrações de 0, 20, 40, 60 e 80 pg/μL preparadas em 1x PBS em ambos os canais da primeira configuração do fluorímetro. Cada amostra foi medida três vezes com uma exposição led de 1,5 s em intervalos de 20 s. Ambos os canais do fluorímetro mostram uma resposta linear em toda a faixa desejada. A aplicabilidade clínica do fluorímetro foi ainda demonstrada utilizando o sistema juntamente com um bloco de calor seco comercialmente disponível para realizar a amplificação com duas tecnologias de amplificação isotérmica: RPA e RT-LAMP. A Figura 3B demonstra o curso de tempo subtraído de fluorescência medido durante a amplificação de 39 °C de 50 μL de reações de controle positivo e negativo de RPA em tempo real para o DNA de controle positivo do kit fornecido em um kit comercial padrão e preparado por instruções do fabricante. As reações de RPA, que produzem um nível relativamente baixo de fluorescência, foram medidas usando a primeira configuração do fluorímetro que consegue uma melhor supressão da luz de excitação. A Figura 3C demonstra a medição do curso de tempo de um ensaio rt-lamp personalizado a 65 °C utilizando os conjuntos de primer N2, E1 e As1e descritos por Zhang et al10, e Rabe e Cepko11. As reações RT-LAMP produzem uma maior quantidade de fluorescência e foram medidas utilizando-se a segunda configuração fluorímetro de menor custo. Os oligonucleotídeos foram comprados e resuspensados em tampão 2x TE em uma concentração de 1 mM. Primer interno dianteiro (FIP) e oligos de primer interno retrógrado (BIP) foram ordenados com purificação de cromatografia líquida de alto desempenho. Cada conjunto de primer (N2, E1, e As1e) foram combinados para fazer 1000 μL de um mix de 25x da seguinte forma: 40 μL de FIP, 40 μL de BIP, 5 μL de F3, 5 μL de B3, 10 μL de LF, 10 μL de LB e 890 μL de 1x te tampão. Para montar cada reação RT-LAMP, 1 μL de cada conjunto de primer foi adicionado a 0,5 μL de corante fluorescente de 50x e 12,5 μL de mix mestre de 2x e o volume de reação foi trazido até 20 μL com água sem nuclease por instruções do fabricante. O Sars-CoV-2 RNA Control foi diluído em água livre de nuclease para concentrações de 10, 100 ou 1.000 cópias por μL, e 5 μL foram adicionados para um volume total de reação de 25 μL. O não controle de alvo (NTC) usado em todos os experimentos foi a água sem nuclease. As reações RT-LAMP foram sobrepostas com 25 μL de óleo mineral de grau de biologia molecular. As reações RPA e RT-LAMP foram montadas em dois poços de uma tira PCR de 8 tubos de baixo perfil de 0,2 mL e tampadas com tampas planas ultracleares. Cada reação de RPA e RT-LAMP foi executada em triplicado. Em todos os testes, o mini-fluorímetro quantificou com sucesso o aumento temporal dos níveis de fluorescência associados à amplificação do DNA. Figura 1: Carcaça óptica e fluorímetro em miniatura montado no topo do bloco de calor. (A) Diagrama de carcaça óptica mostrando componentes ópticos colocados em um canal de detecção. (B) Diagrama da primeira configuração do fluorímetro em miniatura após o montagem. (C) Fotografia da carcaça óptica com componentes ópticos colocados em um canal de detecção. (D) Fotografia de fluorímetro em miniatura montado colocado em cima de um bloco de calor comercialmente disponível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Diagrama de montagem e controle elétrico do fluorímetro em miniatura. A-J) Colocação passo a passo dos componentes ópticos na carcaça óptica impressa em 3D para a primeira configuração do sistema. (K) Diagrama elétrico do fluorímetro em miniatura para ambas as configurações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: As medidas representativas obtidas com o fluorímetro em miniatura. (A) Fluorescência medida vs. concentração de corante FITC em ambos os canais mostram resposta linear em toda a faixa dinâmica desejada. (B) Fluorescência em tempo real versus tempo para amplificação isotemal de controles positivos e negativos de um kit comercialmente disponível. A amplificação ocorre como esperado para o controle positivo. (C) Fluorescência em tempo real versus tempo para amplificação isotemal de 50, 500 e 5000 cópias de RNA SARS-CoV-2 e uma amostra NTC de um ensaio RT-LAMP personalizado. A amplificação ocorre como esperado perto do limite de detecção do ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Sistema 1 Sistema 2 item quantidade Preço total (USD) quantidade Preço total (USD) Componentes ópticos Lentes 6 158.14 6 158.14 Espelhos 2 244.56 2 60 Filtros ópticos 4 200 6 5 Subtotal 602.7 Subtotal 223.14 Iluminação e Detecção Leds 2 72.62 2 72.62 LED Driver 1 11.49 1 11.49 fotodiodo 2 50 2 50 Subtotal 134.11 Subtotal 134.11 Eletrônica e Exibição Arduino Nano 1 20.7 1 20.7 Pi de Framboesa 1 35 1 35 Tela LCD 1 25 1 25 Mini Breadboard 1 4 1 4 Fonte de alimentação de 10V 1 8.6 1 8.6 Subtotal 93.3 Subtotal 93.3 Custo Total (USD) 830.11 450.55 Tabela 1: Comparação de custos das duas configurações do fluorímetro em miniatura. Arquivo Suplementar 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo Suplementar 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl e clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo Suplementar 3: LCD_Screen_Holder.stl Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo Suplementar 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo Suplementar 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl e clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo Suplementar 6: System2_BuildInstructions.pdf Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo de codificação suplementar 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino Clique aqui para baixar este Arquivo de Codificação. Arquivo de codificação suplementar 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py Clique aqui para baixar este Arquivo de Codificação.

Discussion

Descrito aqui é um fluorímetro de código aberto, de baixo custo, modular e portátil para detecção quantitativa de fluorescência de reações de amplificação isotemal. Projetos de código aberto facilitam a manutenção rápida e barata com peças de substituição prontamente disponíveis e permitem aos usuários a flexibilidade de adaptar o sistema às suas necessidades com base no design modular. Este protocolo descreve o processo de montagem de componentes mecânicos, ópticos e elétricos e validação do desempenho óptico. Além disso, demonstrou-se a flexibilidade do fluorímetro para monitorar dois tipos diferentes de ensaios de amplificação isotérmica com requisitos de temperatura, volume e fluorescência significativamente diferentes, RPA exo e RT-LAMP. O RPA é realizado a 39 °C em reações de 50 μL que utilizam uma sonda marcada por FAM para geração de fluorescência, enquanto o RT-LAMP é realizado a 65 °C em um volume de reação de 25 μL e usa um corante intercalante para relatar a presença do DNA amplificado. Como as medidas de fluorescência são feitas através da parte superior dos tubos PCR com tampas planas, o fluorímetro é capaz de detectar fluorescência de ambos os volumes de ensaio, e os requisitos de calor são limitados apenas pelo bloco de calor comercial escolhido. Além disso, a intensidade de fluorescência produzida em RT-LAMP é quase na ordem de magnitude maior do que a produzida em RPA, devido aos métodos baseados em corante versus sonda de geração de sinais de fluorescência. No entanto, o alcance dinâmico do sensor óptico escolhido pode detectar e quantificar tanto os sinais, quanto os algoritmos de subtração da linha de base explicam essas diferenças para produzir leituras confiáveis de fluorescência.

Para facilitar a disseminação da tecnologia e minimizar o custo potencial de manutenção, foi empregado um design modular compatível com aquecedores amplamente disponíveis em diferentes configurações. No protocolo atual, foi utilizado um aquecedor comum de blocos secos; o mesmo design óptico e elétrico pode ser prontamente adaptado para outros aquecedores disponíveis comercialmente. Se outro aquecedor de blocos secos for usado, serão necessárias mudanças mínimas no projeto de habitação 3D. Especificamente, os pinos inferiores dos arquivos STL do gabinete óptico devem ser modificados para garantir o alinhamento adequado com os poços de outros blocos de calor comerciais. Embora os gabinetes mostrados nos exemplos tenham sido impressos em uma impressora 3D relativamente low-end (ver Tabela de Materiais),deve-se tomar cuidado para garantir que as tolerâncias de resolução e/ou impressão da impressora sejam adequadas para acomodar os componentes ópticos e as pastilhas roscadas. Nos arquivos STL fornecidos, foi adicionada uma tolerância de 0,01-0,02 polegadas em ambos os lados dos componentes ópticos nas direções radial e axial com base nas dimensões especificadas pelo fabricante. Isso garante que todos os componentes ópticos se encaixem firmemente dentro da impressão e que o gabinete bloqueie completamente o excesso de luz de entrar ou escapar. Para garantir uma prensa adequada para as pastilhas roscadas, uma tolerância semelhante de 0,01-0,02 polegadas foi subtraída do diâmetro fornecido pelo fabricante no arquivo CAD.

As reações de RPA foram monitoradas com sucesso usando a primeira configuração fluorímetro, enquanto as reações RT-LAMP poderiam ser monitoradas usando qualquer configuração. A melhor rejeição da luz perdida da primeira configuração foi necessária para monitorar os baixos níveis de fluorescência produzidos pela sonda fluorogênica em reações de RPA. Em contraste, o RT-LAMP utiliza um corante intercalante para geração de sinal, resultando em uma maior intensidade de fluorescência compatível com a faixa dinâmica mais baixa da segunda configuração usando folhas de filtro fotográfico. Os usuários devem selecionar a configuração fluorímetro que corresponda ao sinal de fluorescência que gera corante intercalante de elementos ou sonda fluorogênica de seu ensaio.

Uma limitação deste sistema é que o aquecimento é fornecido por um bloco de calor comercialmente disponível alimentado através de uma tomada de parede padrão. Este sistema poderia ser desenvolvido para uso em áreas sem acesso confiável à eletricidade, incorporando baterias portáteis e recarregáveis, como mostrado por outros grupos12. Outra limitação é o rendimento relativamente baixo do sistema, que permite a medição simultânea da fluorescência de apenas duas amostras por vez. Várias impressões do gabinete podem ser colocadas no topo do mesmo bloco de calor para aumentar a produtividade; no entanto, o sensor de luz usado só tem quatro endereços I2C únicos. Isso restringe o número máximo de amostras que podem ser simultaneamente medidas para quatro. Um sensor de luz diferente com um número maior de endereços I2C exclusivos é necessário para aumentar ainda mais o rendimento.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecimentos especiais a Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul e Christopher Goh por sua ajuda com a preparação da amostra. Os autores agradecem a Caroline Noxon pela revisão do manuscrito. O financiamento para este trabalho foi fornecido do povo americano pela USAID através de uma bolsa de pesquisa da IAVI CCID 9204 sob o prêmio AID-OAA-A16-00032 entre a IAVI e a USAID.

Materials

1/4-inch-long 4-40 threaded insert McMaster-Carr 90742A116 Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
10v power supply GlobTek, Inc. WR9HU1800CCP-F(R6B) AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W
15 mm focal length lens Thorlabs LA 1074 Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination.
1-inch-long 4-40 screws McMaster-Carr
20 mm focal length lens Thorlabs LA 1540 Four total are used for the fluorimeter.
2x WarmStart LAMP Master Mix New England Biolabs, Inc E1700 Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C
3.5” Touch Screen Uctronics BO10601
3/16-inch-long 4-40 screw McMaster-Carr 90128A105
3/16-inch-long 4-40 threaded insert McMaster-Carr 90742A115 Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure
3/8-inch-long 4-40 screws McMaster-Carr 90128A108 Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
3D printer filament 3D Universe UMNFC-PC285-BLACK Black or another dark color preferred
3D printer used Ultimaker Ultimaker 2+
8-tube PCR strips BioRad #TLS0801
Advanced Mini Dry Block Heater VWR International 10153-320 The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU
barrel jack to two-pin adapter SparkFun Electronics 1568-1238-ND
Blue Excitation Filter Foil LEE LE071S Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters.
Blue LED – 460 nm Mouser LZ1-30DB00-0100 Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
Dichroic Mirror Thorlabs DMLP505T Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
Emission Filter Edmunds Optics OG-515 Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source.
Excitation Filter Omega Filters 490AESP Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
LED Driver LEDdynamics 3021-D-I-700
M2.5 Hex Shaped insert McMaster-Carr 91292A009 Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder
Microcontroller Arduino Nano
Mini Breadboard Adafruit 65
Molecular biology-grade mineral oil Sigma Aldrich 69794
OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor Texas Instruments OPT3002EVM: Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. 
Purchased oligonucleotides Integrated DNA Technologies
RPA kit positive control DNA TwistDx Limited CONTROL01DNAE
SARS-CoV-2 RNA Control Twist Biosciences MN908947.3
Single board computer Raspberry Pi Raspberry Pi 3
TwistAmp RPA exo kit TwistDx Limited TAEXO02KIT
Ultraclear flat caps BioRad #TCS0803
Yellow Emmission Filter Foil LEE LE767S Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
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References

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Coole, J., Kortum, A., Tang, Y., Vohra, I., Maker, Y., Kundrod, K., Natoli, M., Richards-Kortum, R. Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings. J. Vis. Exp. (168), e62148, doi:10.3791/62148 (2021).
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