פלואורימטר מיניאטורי בקוד פתוח לניטור תגובות הגברה של חומצות גרעין איזותרמיות בזמן אמת בהגדרות מוגבלות במשאבים
Summary
הוראות מפורטות ניתנות לבניית פלואורימטר מודולרי בקוד פתוח התואם לתנורי חימום רבים בעלות נמוכה לביצוע הגברה של חומצת גרעין איסותרמית כמותית בזמן אמת.
Abstract
שיטות מסורתיות לגילוי וכימות חומצות גרעין מסתמכות על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ודורשות שימוש בתרמוציקלרים יקרים עם זיהוי פלואורסצנטי משולב של אמפליקונים. טכנולוגיות הגברה של חומצות גרעין איסותרמיות מבטלות את הצורך ברכיבה תרמית; עם זאת, זיהוי מבוסס פלואורסצנטיות של מוצרים עדיין נדרש לתוצאות כמותיות בזמן אמת. מספר תנורי חימום איסותרמיים ניידים עם זיהוי פלואורסצנטי משולב זמינים כעת מסחרית; עם זאת, העלות של התקנים אלה נותרה חסם משמעותי לאימוץ נרחב בהגדרות מוגבלות משאבים. להלן פרוטוקול לתכנון והרכבה של פלואורימטר מודולרי בעלות נמוכה הבנוי מרכיבים מחוץ למדף. מוקף דיור מודפס 3D קומפקטי, הפלואורימטר נועד להיות ממוקם על גבי בלוק חום זמין מסחרית מחזיק צינור PCR. הפלואורימטר המתואר כאן היה אופטימיזציה כדי לזהות פלואורסצנטין isothiocyanate (FITC) צבע, אבל המערכת יכולה להיות שונה לשימוש עם צבעים נפוץ ככתבים בתגובות הגברה חומצת גרעין בזמן אמת. הישימות הקלינית של המערכת מודגמת על ידי ביצוע זיהוי חומצות גרעין בזמן אמת עם שתי טכנולוגיות הגברה איסותרמיות: הגברה פולימראז recombinase (RPA) לגילוי DNA שליטה חיובית המסופקת בערכה מסחרית והגברת isothermal בתיווך לולאה הפוכה (RT-LAMP) לגילוי רמות משמעותיות קלינית של SARS-CoV-2 RNA.
Introduction
טכנולוגיות הגברה Isothermal נמצאים בשימוש נרחב לגילוי של חומצות גרעין. בהשוואה לגישות PCR מסורתיות הדורשות תרמוציקלינג, הגברה איזותרמית מאפשרת הגברה של חומצת גרעין להתרחש בטמפרטורה אחת, ובכך מאפשרת זמן לתוצאות מהיר יותר וסובלנות טובה יותר של מעכבים1,2. יתרון מרכזי נוסף של הגברה איסותרמית הוא מורכבות המכשור המופחתת. רוב תגובות הגברה isothermal רק דורשים בלוק חום וזיהוי מודאליות – או זיהוי בזמן אמת באמצעות ניטור פלואורסצנטיות או זיהוי נקודת קצה, למשל על ידי זרימה לרוחב או אלקטרופורזה ג’ל3,4. זיהוי פלואורסצנטיות בזמן אמת מושגת באמצעות זיהוי פלואורסצנטיות המיוצרת על ידי צבעים משולבים המופעלים בנוכחות דנ”א דו-גדילי או בדיקות פלואורסצנטיות מרווה המופעלות בנוכחות רצפי דנ”א דו-גדיליים ספציפיים.
בעוד פלואורימטרים איזותרמיים זמינים מסחרית על הספסל קיימים, רבים חסרים התאמה אישית ליישום מבחנים. לדוגמה, מכשירים רבים דורשים חומרים מתכלים ספציפיים או שסופקו על-ידי החברה, ממליצים על ספקים מועדפים או משתמשים בתוכנות קנייניות כדי להשיג תוצאות שפורסמו. רוב המערכות הללו עולות יותר מ-5,000 דולר, מה שמייצג מחסום משמעותי לשימוש נרחב במסגרות המוגבלות במשאבים. בנוסף, משתמשים בהגדרות בעלות משאבים נמוכים מתמודדים עם אתגרים לתחזוקת ציוד המיועד להגדרות בעלות משאבים גבוהים בשל תנאי סביבה קשים, שרשראות אספקה חלשות לחלקי חילוף וכלים מיוחדים הדרושים לתחזוקה ותיקון5. כדי לענות על צורך זה, המתואר כאן הוא העיצוב וההרכבה של פלואורימטר מודולרי בעלות נמוכה שנבנה מרכיבים מן המדף מוקף דיור מודפס 3D קומפקטי (איורים 1A–C) עם שתי תצורות אופציונליות. התצורה הראשונה של מכשיר זה משתמשת במסנני זכוכית זמינים מסחרית ומראה dichroic כדי לחסום אור רקע עודף ויש לו עלות כוללת של הרכבה של $830 USD. בעוד מסננים אלה משמשים בדרך כלל במערכות הדמיה מבוססות פלואורסצנטיות, החלפת רדידים אופטיים יקרים בדרגה גבוהה הוכח בעבר לאפשר זיהוי חומצת גרעין6. התצורה השנייה של הפלואורימטר משלבת מסננים זולים אלה ומחליפה את המראות הדיכריות במפצלי קרן φ1/2 אינץ’, מה שמפחית את העלות הכוללת של המערכת מ$830 דולר ל$450 דולר.
תמונות מייצגות של ההרכבה מוצגות לתצורה הראשונה באיור 1 ובאיור 2, אך תמונות מקבילות לתצורה השנייה ניתן למצוא בקובץ משלים 6. כדי למנוע את הצורך ביישור אופטי מיוחד, למערכת האופטית יש אזורים ייעודיים למקם כל רכיב אופטי וניתן לבצע אותה באמצעות מדפסת תלת-ממד נמוכה יחסית, המאפשרת שימוש נרחב בתכנון. ההבדלים היחידים בבנייה ובהרכבה עבור שתי התצורות הם הקבצים המשמשים להדפסה בתלת-ממד והרכיבים האופטיים הממוקמים במארז. הממדים החיצוניים של המארז המודפס בתלת-ממד עבור שתי המערכות זהים. השוואת עלויות בין שתי המערכות מוצגת בטבלה 1.
כפי שמוצג באיור 1A, כדי לשמור על גורם צורה קטן, הפלואורימטר מורכב מאופטיקה של Φ1/2 אינץ’ (כ-12.5 מ”מ), יחד עם תאורה קומפקטית וזיהוי הממוקמים למדידת אות דרך החלק העליון של צינור PCR. המערכת באיור 1 נועדה לזהות צבעים עם אורכי גל של עירור ופליטה קרובים ל-490 ננומטר ו-525 ננומטר, בהתאמה, כולל FITC וצבעים קרובים כמו SYBR ו-SYTO-9, המשמשים בדרך כלל ככתבים בתגובות הגברה של חומצות גרעין בזמן אמת7,8. ניתן להחליף בקלות את מקור העירור, המסננים האופטיים והגלאי ברכיבים התואמים לצבעים פלואורסצנטיים שונים לפי הצורך. תגובות הגברה של חומצות גרעין מבוצעות בדרך כלל בצינורות PCR, והפלואוריאמטר מתוכנן להיות ממוקם מעל כל בלוק חום מסחרי זמין המחזיק צינורות PCR (איור 1D) המאפשר ניטור בזמן אמת של תגובות איזותרמיות. בלוקי חום מתאימים זמינים ברוב המעבדות הביו-רפואיות וניתן לרכוש אותם בפחות מ- $500 USD.
השימוש במחשבים חד-לוחיים כדי לספק חלופה זולה של טיפול בשליטה בטכנולוגיות הדמיה הוכח בעבר9. בהסתמך על עבודה זו, בפרוטוקול זה נעשה שימוש בממשק משתמש גרפי המופעל באמצעות מחשב יחיד (איור 1D) כדי להקל על רישום נתונים בזמן אמת והצגת תוצאות בנקודת הטיפול, ובכך מבטל את הצורך במחשב נייד לעבד או לדמיין נתונים. מדידות פלואורסצנטיות הועברו דרך פרוטוקול I2C מחיישני האור למיקרו-בקר, ולאחר מכן הפכו לזמינות למחשב בעל לוח יחיד באמצעות תקשורת טורית. חיבורים חשמליים לתאורה והעברת נתונים סופקו באמצעות חיווט פשוט והלחמה על לוחות לחם ממוזערים, ובכך שללו את הצורך בלוחות מעגלים מודפסים (PCB) מיוחדים. התוכנה הנדרשת להפעלת הפלואורימטר זמינה באמצעות מסגרות תוכנה בקוד פתוח והקוד הדרוש להפעלת ההתקן מסופק בקבצי הקידוד המשלימים. פלואורימטר מלא ניתן להרכיב בין $450 כדי $830 USD, והתוצאות מראות כי הוא מספק מדידות פלואורסצנטיות מדויקות ואמינות כדי לפקח על הגברה isothermal בזמן אמת של חומצות גרעין.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתואר כאן הוא קוד פתוח, בעלות נמוכה, מודולרי, פלואורימטר נייד לגילוי פלואורסצנטיות כמותית של תגובות הגברה isothermal. פרויקטי קוד פתוח מאפשרים תחזוקה מהירה וזולה עם חלקי חילוף זמינים ומאפשרים למשתמשים את הגמישות להתאים את המערכת לצרכיהם על בסיס עיצוב מודולרי. פרוטוקול זה מתאר את תהליך הרכבת הרכיבים המכניים, האופטיים והחשמליים ואימות הביצועים האופטיים. יתר על כן, הגמישות של הפלואורימטר כדי לפקח על שני סוגים שונים של מבחני הגברה איזותרמיים עם דרישות טמפרטורה, נפח ופלואורסצנטיות שונות באופן משמעותי, RPA exo ו- RT-LAMP, הודגם. RPA מבוצע ב 39 °C (69 °F) ב 50 תגובות μL המשתמשות בדיקה ספציפית לרצף FAM מתויג עבור יצירת פלואורסצנטיות, בעוד RT-LAMP מבוצע ב 65 °C (65 °F) בנפח תגובת μL 25 ומשתמש צבע intercalating לדווח על נוכחות של ה-DNA מוגברת. מכיוון שמדידות פלואורסצנטיות מתבצעות דרך החלק העליון של צינורות PCR עם כובעים שטוחים, הפלואורימטר מסוגל לזהות פלואורסצנטיות משני נפחי ההסתעפות, ודרישות החום מוגבלות רק על ידי בלוק החום המסחרי שנבחר. יתר על כן, עוצמת הפלואורסצנטיות המיוצרת ב- RT-LAMP היא כמעט בסדר גודל גדול מזה המיוצר ב- RPA, בשל שיטות מבוססות צבע לעומת בדיקה של ייצור אותות פלואורסצנטיים. עם זאת, הטווח הדינמי של החיישן האופטי שנבחר יכול לזהות ולכמת הן את האותות והן את אלגוריתמי החיסור הבסיסיים מסבירים את ההבדלים הללו כדי לייצר קריאות פלואורסצנטיות אמינות.
כדי להקל על הפצת טכנולוגיה ולמזער את עלות התחזוקה הפוטנציאלית, הופעל עיצוב מודולרי התואם לתנורים הזמינים באופן נרחב במסגרות שונות. בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בתנור בלוק יבש משותף; אותו עיצוב אופטי וחשמלי יכול להיות מותאם בקלות עבור תנורי חימום מסחריים אחרים זמינים. אם יש להשתמש בתנור בלוק יבש נוסף, יידרשו שינויים מינימליים בתכנון הדיור בתלת-ממד. באופן ספציפי, היתדות התחתונות של קבצי STL המתחם האופטי חייב להיות שונה כדי להבטיח יישור נכון עם בארות של בלוקי חום מסחריים אחרים. בעוד שהמארזים המוצגים בדוגמאות הודפסו במדפסת תלת-ממד נמוכה יחסית (ראה טבלת חומרים),יש להקפיד לוודא שרזולוציית המדפסת ו/או טולרנס ההדפסה מתאימים לרכיבים האופטיים ולתוספות הליכי המשנה. בקבצי STL שסופקו, נוספה עמידות של 0.01-0.02 אינץ’ משני צדי הרכיבים האופטיים בכיוונים הרדיאליים והאקסיאליים בהתבסס על הממדים שצוינו על-ידי היצרן. פעולה זו מבטיחה שכל הרכיבים האופטיים יתאימו בצורה מאובטחת להדפסה ושהמארז חוסם לחלוטין את הכניסה או הבריחה של אור עודף. כדי להבטיח התאמה נכונה של הלחיצה עבור התוספות המשורשרות, סטייה דומה של 0.01-0.02 אינץ’ הופטרה מהקוטר שסופק על-ידי היצרן בקובץ ה- CAD.
תגובות RPA נוטרו בהצלחה באמצעות תצורת הפלואורימטר הראשונה, בעוד שניתן היה לפקח על תגובות RT-LAMP באמצעות כל אחת מהתצורות. דחיית האור התועה המשופרת של התצורה הראשונה הייתה הכרחית כדי לפקח על רמות נמוכות של פלואורסצנטיות המיוצר על ידי החללית פלואורוגנית בתגובות RPA. לעומת זאת, RT-LAMP משתמש בצבע בין-צירי ליצירת אותות, וכתוצאה מכך עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר התואמת לטווח הדינמי הנמוך יותר של התצורה השנייה באמצעות רדידי מסנן צילום. משתמשים צריכים לבחור את תצורת הפלואורימטר התואמת לאות הפלואורסצנטי המייצר צבע בין רכיבים או בדיקה פלואורוגנית של הבדיקה שלהם.
מגבלה אחת של מערכת זו היא כי החימום מסופק על ידי בלוק חום זמין מסחרית מופעל באמצעות שקע קיר סטנדרטי. מערכת זו יכולה להיות מפותחת עוד יותר לשימוש באזורים חסרי גישה אמינה לחשמל על ידי שילוב מארזי סוללות ניידים ונטענים כפי שמוצג על ידי קבוצות אחרות12. מגבלה נוספת היא התפוקה הנמוכה יחסית של המערכת, המאפשרת מדידת פלואורסצנטיות בו זמנית של שתי דגימות בלבד בכל פעם. הדפסים מרובים של המארז ניתן למקם על גבי אותו בלוק חום כדי להגדיל את התפוקה; עם זאת, חיישן האור המשמש יש רק ארבע כתובות ייחודיות I2C. פעולה זו מגבילה את המספר המרבי של דגימות שניתן למדוד בו זמנית לארבעה. חיישן אור שונה עם מספר גדול יותר של כתובות I2C ייחודיות נדרש כדי להגדיל עוד יותר את התפוקה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה מיוחדת לצ’לסי סמית’, מייגן צ’אנג, אמילי ניושאם, סאי פול וכריסטופר גו על עזרתם בהכנת מדגם. המחברים מודים לקרוליין נוקסון על תיקון כתב היד. מימון עבור עבודה זו סופק מהעם האמריקאי על ידי USAID באמצעות מענק מחקר IAVI CCID 9204 תחת פרס AID-OAA-A16-00032 בין IAVI ו USAID.
Materials
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED – 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
References
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
