Open-Source-Miniaturfluorimeter zur Überwachung isothermer Nukleinsäureverstärkungsreaktionen in Echtzeit in ressourcenbegrenten Umgebungen
Summary
Detaillierte Anweisungen werden bereitgestellt, um ein modulares Open-Source-Fluorimeter zu bauen, das mit vielen kostengünstigen Heizgeräten kompatibel ist, um eine quantitative isotherme Nukleinsäureamplifikation in Echtzeit durchzuführen.
Abstract
Herkömmliche Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von Nukleinsäuren basieren auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und erfordern den Einsatz teurer Thermocycler mit integrierter Fluoreszenzdetektion von Ampliconen. Isotherme Nukleinsäure-Amplifikationstechnologien eliminieren die Notwendigkeit von thermischen Zyklen; Für quantitative Echtzeitergebnisse ist jedoch nach wie vor eine fluoreszenzbasierte Detektion von Produkten erforderlich. Mehrere tragbare isotherme Heizgeräte mit integrierter Fluoreszenzerkennung sind jetzt im Handel erhältlich; Die Kosten für diese Geräte sind jedoch nach wie vor ein erhebliches Hindernis für eine breite Akzeptanz in umgebungen mit begrenzten Ressourcen. Hier wird ein Protokoll für die Konstruktion und Montage eines modularen, kostengünstigen Fluorimeters beschrieben, das aus standardmäßigen Komponenten besteht. Das Fluorimeter ist in einem kompakten 3D-gedruckten Gehäuse untergebracht und so konzipiert, dass es auf einem handelsüblichen Wärmeblock mit einer PCR-Röhre platziert werden kann. Das hier beschriebene Fluorimeter wurde optimiert, um Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Farbstoff nachzuweisen, aber das System kann für die Verwendung mit Farbstoffen modifiziert werden, die üblicherweise als Reporter in Echtzeit-Nukleinsäureamplifikationsreaktionen verwendet werden. Die klinische Anwendbarkeit des Systems wird durch die Durchführung eines Echtzeit-Nukleinsäurenachweises mit zwei isothermen Amplifikationstechnologien nachgewiesen: Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) zum Nachweis von Positivkontroll-DNA, die in einem kommerziellen Kit bereitgestellt wird, und Reverse-Transkriptionsschleifen-vermittelte isotherme Amplifikation (RT-LAMP) zum Nachweis klinisch bedeutsamer SARS-CoV-2-RNA-Spiegel.
Introduction
Isotherme Amplifikationstechnologien werden häufig zum Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt. Im Vergleich zu herkömmlichen PCR-Ansätzen, die Thermocycling erfordern, ermöglicht die isotherme Amplifikation die Nukleinsäureamplifikation bei einer einzigen Temperatur, wodurch eine schnellere Zeit bis zu den Ergebnissen und eine bessere Toleranz der Inhibitoren1,2ermöglicht werden. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der isothermen Verstärkung ist die reduzierte Komplexität der Instrumentierung. Die meisten isothermen Amplifikationsreaktionen erfordern nur einen Wärmeblock und eine Detektionsmodalität – entweder Echtzeitdetektion über Fluoreszenzüberwachung oder Endpunktdetektion, zum Beispiel durch Lateralfluss oder Gelelektrophorese3,4. Die Echtzeit-Fluoreszenzdetektion wird durch den Nachweis von Fluoreszenz erreicht, die durch die Interkalation von Farbstoffen erzeugt wird, die in Gegenwart von doppelsträngiger DNA oder abgeschreckten Fluoreszenzsonden aktiviert werden, die in Gegenwart spezifischer doppelsträngiger DNA-Sequenzen aktiviert werden.
Während kommerziell erhältliche isotherme Fluorimeter auf dem Tisch existieren, fehlt es vielen an Anpassungen für die Assay-Implementierung. Beispielsweise benötigen viele Geräte bestimmte oder vom Unternehmen bereitgestellte Verbrauchsmaterialien, empfehlen bevorzugte Anbieter oder verwenden proprietäre Software, um beworbene Ergebnisse zu erzielen. Die meisten dieser Systeme kosten über 5.000 USD, was ein erhebliches Hindernis für den weit verbreiteten Einsatz in ressourcenbegrenten Umgebungen darstellt. Darüber hinaus stehen Benutzer in ressourcenarmen Umgebungen vor der Herausforderung, Geräte zu warten, die für ressourcenreiche Umgebungen aufgrund rauer Umgebungsbedingungen, schwacher Lieferketten für Ersatzteile und spezialisierter Werkzeuge, die für Wartung und Reparatur erforderlich sind, ausgelegtsind 5. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wird hier das Design und die Montage eines modularen und kostengünstigen Fluorimeters beschrieben, das aus handelsüblichen Komponenten besteht, die in einem kompakten 3D-gedruckten Gehäuse (Abbildungen 1A–C) mit zwei optionalen Konfigurationen eingeschlossen sind. Die erste Konfiguration dieses Geräts verwendet handelsübliche Glasfilter und einen dichroitischen Spiegel, um überschüssiges Hintergrundlicht zu blockieren, und hat Gesamtkosten für die Montage von 830 USD. Während diese Filter häufig in fluoreszenzbasierten Bildgebungssystemen verwendet werden, wurde bereits gezeigt, dass der Ersatz teurer hochwertiger optischer Filterfolien den Nachweis von Nukleinsäure ermöglicht6. Die zweite Konfiguration des Fluorimeters enthält diese kostengünstigen Filter und ersetzt die dichroitischen Spiegel durch φ1/2 “-Strahlteiler, wodurch die Gesamtkosten des Systems von 830 usd auf 450 USD gesenkt werden.
Repräsentative Bilder der Baugruppe werden für die erste Konfiguration in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt, aber analoge Bilder für die zweite Konfiguration finden Sie in Zusatzdatei 6. Um die Notwendigkeit einer speziellen optischen Ausrichtung zu vermeiden, verfügt das optische System über ausgewiesene Bereiche, in denen jede optische Komponente angeordnet werden kann, und kann mit einem relativ niedrigen 3D-Drucker hergestellt werden, was eine weit verbreitete Verwendung des Designs ermöglicht. Die einzigen Unterschiede in Konstruktion und Montage für die beiden Konfigurationen sind die für den 3D-Druck verwendeten Dateien und die optischen Komponenten, die im Gehäuse platziert sind. Die Außenmaße des 3D-gedruckten Gehäuses für beide Systeme sind gleich. Ein Kostenvergleich der beiden Systeme ist in Tabelle 1 dargestellt.
Wie in Abbildung 1Agezeigt, besteht das Fluorimeter zur Aufrechterhaltung eines kleinen Formfaktors aus Φ1/2″ (~12,5 mm) Optiken, gekoppelt mit kompakter Beleuchtung und Detektion, die zur Messung des Signals durch die Oberseite der PCR-Röhre platziert werden. Das System in Abbildung 1 wurde entwickelt, um Farbstoffe mit Spitzenanregungs- und Emissionswellenlängen nahe 490 nm bzw. 525 nm nachzuweisen, einschließlich FITC und eng verwandter Farbstoffe wie SYBR und SYTO-9, die üblicherweise als Reporter in Echtzeit-Nukleinsäureverstärkungsreaktionen verwendet werden7,8. Die Anregungsquelle, die optischen Filter und der Detektor können leicht durch Komponenten ersetzt werden, die mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen kompatibel sind. Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen werden typischerweise in PCR-Röhrchen durchgeführt, und das Fluorimeter ist so konzipiert, dass es auf jedem kommerziell erhältlichen Wärmeblock platziert werden kann, der PCR-Röhrchen enthält(Abbildung 1D),was eine Echtzeitüberwachung isothermer Reaktionen ermöglicht. Entsprechende Wärmeblöcke sind in den meisten biomedizinischen Labors erhältlich und können für weniger als 500 USD erworben werden.
Die Verwendung von Einplatinencomputern zur Bereitstellung einer kostengünstigen Point-of-Care-Alternative zur Steuerung von Bildgebungstechnologien wurde bereits demonstriert9. Aufbauend auf dieser Arbeit wird in diesem Protokoll eine einplatinenbasierte computergestützte grafische Benutzeroberfläche (Abbildung 1D) verwendet, um die Echtzeit-Datenprotokollierung und -anzeige der Ergebnisse am Point of Care zu erleichtern, wodurch die Notwendigkeit für einen Laptop-Computer zur Verarbeitung oder Visualisierung von Daten entfällt. Fluoreszenzmessungen wurden über dasI2C-Protokoll von den Lichtsensoren auf einen Mikrocontroller übertragen und dann dem Einplatinencomputer durch serielle Kommunikation zur Verfügung gestellt. Elektrische Verbindungen für Beleuchtung und Datenübertragung wurden durch vereinfachte Verdrahtung und Löten auf miniaturisierten Steckplatinen bereitgestellt, wodurch die Notwendigkeit spezieller Leiterplatten (PCBs) entfiel. Die software, die zum Ausführen des Fluorimeters erforderlich ist, ist über Open-Source-Software-Frameworks verfügbar, und der zum Ausführen des Geräts erforderliche Code wird in den zusätzlichen Codierungsdateienbereitgestellt. Das komplette Fluorimeter kann für 450 bis 830 USD montiert werden, und die Ergebnisse zeigen, dass es genaue und zuverlässige Fluoreszenzmessungen zur Überwachung der isothermalen Amplifikation von Nukleinsäuren in Echtzeit liefert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird ein kostengünstiges, modulares, tragbares Open-Source-Fluorimeter zur quantitativen Fluoreszenzdetektion isothermer Amplifikationsreaktionen beschrieben. Open-Source-Projekte ermöglichen eine schnelle und kostengünstige Wartung mit leicht verfügbaren Ersatzteilen und ermöglichen Anwendern die Flexibilität, das System modular aufgebaut an ihre Bedürfnisse anzupassen. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Montage mechanischer, optischer und elektrischer Komponenten und der Validierung der optischen Leistung. Darüber hinaus wurde die Flexibilität des Fluorimeters zur Überwachung von zwei verschiedenen Arten von isothermen Amplifikationsassays mit signifikant unterschiedlichen Temperatur-, Volumen- und Fluoreszenzanforderungen, RPA exo und RT-LAMP, demonstriert. RPA wird bei 39 °C in 50 μL-Reaktionen durchgeführt, die eine sequenzspezifische FAM-markierte Sonde zur Fluoreszenzerzeugung verwenden, während RT-LAMP bei 65 °C in einem Reaktionsvolumen von 25 μL durchgeführt wird und einen interkalierenden Farbstoff verwendet, um das Vorhandensein der amplifizierten DNA zu melden. Da Fluoreszenzmessungen durch die Oberseite von PCR-Röhrchen mit flachen Kappen durchgeführt werden, ist das Fluorimeter in der Lage, Fluoreszenz aus beiden Assay-Volumina zu detektieren, und der Wärmebedarf ist nur durch den gewählten kommerziellen Wärmeblock begrenzt. Darüber hinaus ist die in RT-LAMP erzeugte Fluoreszenzintensität aufgrund der farbstoff- versus sondenbasierten Methoden der Fluoreszenzsignalerzeugung fast um eine Größenordnung größer als die in RPA erzeugte. Der Dynamikbereich des gewählten optischen Sensors kann jedoch sowohl die Signale erkennen als auch quantifizieren, und Die Subtraktionsalgorithmen der Baseline berücksichtigen diese Unterschiede, um zuverlässige Fluoreszenzwerte zu erzeugen.
Um die Verbreitung der Technologie zu erleichtern und potenzielle Wartungskosten zu minimieren, wurde ein modulares Design verwendet, das mit Heizungen kompatibel ist, die in verschiedenen Umgebungen weit verbreitet sind. Im aktuellen Protokoll wurde eine übliche Trockenblockheizung verwendet; das gleiche optische und elektrische Design kann leicht für andere handelsübliche Heizungen angepasst werden. Soll eine weitere Trockenblockheizung verwendet werden, sind minimale Änderungen an der 3D-Gehäusekonstruktion erforderlich. Insbesondere müssen die unteren Stifte der STL-Dateien des optischen Gehäuses modifiziert werden, um eine ordnungsgemäße Ausrichtung mit den Vertiefungen anderer kommerzieller Wärmeblöcke zu gewährleisten. Während die in den Beispielen gezeigten Gehäuse auf einem relativ low-end 3D-Drucker gedruckt wurden (siehe Materialtabelle),sollte darauf geachtet werden, dass die Druckerauflösung und/oder die Drucktoleranzen ausreichend sind, um die optischen Komponenten und Gewindeeinsätze aufzunehmen. In den bereitgestellten STL-Dateien wurde eine Toleranz von 0,01-0,02 Zoll auf beiden Seiten der optischen Komponenten in radialer und axialer Richtung basierend auf den vom Hersteller angegebenen Abmessungen hinzugefügt. Dadurch wird sichergestellt, dass alle optischen Komponenten sicher in den Druck passen und dass das Gehäuse das Eindringen oder Entweichen von überschüssigem Licht vollständig verhindert. Um eine korrekte Presspassung für die Gewindeeinsätze zu gewährleisten, wurde eine ähnliche Toleranz von 0,01-0,02 Zoll vom herstellerspezifischen Durchmesser in der CAD-Datei abgezogen.
RPA-Reaktionen wurden mit der ersten Fluorimeterkonfiguration erfolgreich überwacht, während RT-LAMP-Reaktionen mit beiden Konfigurationen überwacht werden konnten. Die verbesserte Streulichtunterdrückung der ersten Konfiguration war notwendig, um die geringe Fluoreszenz zu überwachen, die von der fluorogenen Sonde bei RPA-Reaktionen erzeugt wurde. Im Gegensatz dazu verwendet RT-LAMP einen interkalierenden Farbstoff zur Signalerzeugung, was zu einer höheren Fluoreszenzintensität führt, die mit dem niedrigeren Dynamikbereich der zweiten Konfiguration mit fotografischen Filterfolien kompatibel ist. Benutzer sollten die Fluorimeterkonfiguration auswählen, die dem Fluoreszenzsignal entspricht, das elementinterkalierenden Farbstoff oder die fluorogene Sonde ihres Assays erzeugt.
Eine Einschränkung dieses Systems besteht darin, dass die Heizung durch einen handelsüblichen Wärmeblock erfolgt, der über eine Standard-Wandsteckdose gespeist wird. Dieses System könnte für den Einsatz in Gebieten ohne zuverlässigen Zugang zu Elektrizität weiterentwickelt werden, indem tragbare und wiederaufladbare Batteriepacks integriert werden, wie von anderen Gruppengezeigt 12gezeigt. Eine weitere Einschränkung ist der relativ geringe Durchsatz des Systems, der eine gleichzeitige Fluoreszenzmessung von nur zwei Proben gleichzeitig ermöglicht. Mehrere Drucke des Gehäuses können auf demselben Wärmeblock platziert werden, um den Durchsatz zu erhöhen. Der verwendete Lichtsensor hat jedoch nur vier eindeutige I2C-Adressen. Dadurch wird die maximale Anzahl der Proben, die gleichzeitig gemessen werden können, auf vier begrenzt. Ein anderer Lichtsensor mit einer größeren Anzahl eindeutiger I2C-Adressen wird benötigt, um den Durchsatz weiter zu erhöhen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Besonderer Dank geht an Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul und Christopher Goh für ihre Unterstützung bei der Probenvorbereitung. Die Autoren danken Caroline Noxon für die Manuskriptrevision. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom amerikanischen Volk von USAID durch einen IAVI-Forschungsstipendium CCID 9204 unter der Auszeichnung AID-OAA-A16-00032 zwischen IAVI und USAID zur Verfügung gestellt.
Materials
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED – 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
References
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