مقياس فلوريمتر مصغر مفتوح المصدر لمراقبة تفاعلات تضخيم حمض النيوكليك Isothermal في الوقت الفعلي في الإعدادات المحدودة الموارد
Summary
يتم توفير تعليمات مفصلة لبناء مفتوحة المصدر، وحدات الفلورمتر التي تتوافق مع العديد من سخانات منخفضة التكلفة لأداء الوقت الحقيقي، والكمي التضخيم حمض النووي isothermal.
Abstract
تعتمد الطرق التقليدية للكشف عن الأحماض النووية وقياسها كميا على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتتطلب استخدام مدورات حرارية باهظة الثمن مع اكتشاف مضان متكامل لل amplicons. تقنيات تضخيم الحمض النووي Isothermal القضاء على الحاجة إلى ركوب الدراجات الحرارية; ومع ذلك، لا يزال الكشف عن المنتجات القائم على الفلورسينس مطلوبا لتحقيق نتائج كمية في الوقت الحقيقي. العديد من سخانات isothermal المحمولة مع الكشف عن مضان متكاملة متاحة الآن تجاريا; ومع ذلك، تظل تكلفة هذه الأجهزة عائقا كبيرا أمام اعتمادها على نطاق واسع في البيئات المحدودة الموارد. وصف هنا هو بروتوكول لتصميم وتجميع وحدات، منخفضة التكلفة الفلوريمتر شيدت من المكونات الجاهزة. تم تصميم مقياس الفلوري، المغلق في مسكن مطبوع ثلاثي الأبعاد مدمج، ليتم وضعه فوق كتلة حرارية متاحة تجاريا تحمل أنبوب PCR. تم تحسين مقياس الفلوريمتر الموصوف هنا للكشف عن صبغة إيزوثيوسيانات الفلورسين (FITC) ، ولكن يمكن تعديل النظام للاستخدام مع الأصباغ المستخدمة عادة كمراسلين في تفاعلات تضخيم حمض النيوكليك في الوقت الحقيقي. ويتجلى التطبيق السريري للنظام من خلال إجراء الكشف عن الحمض النووي في الوقت الحقيقي مع اثنين من تقنيات التضخيم إيزوثرمال: إعادة دمج بوليمرات التضخيم (RPA) للكشف عن الحمض النووي للسيطرة الإيجابية المقدمة في مجموعة تجارية والنسخ العكسي حلقة بوساطة التضخيم الحراري (RT-LAMP) للكشف عن مستويات ذات مغزى سريريا من سارس-CoV-2 RNA.
Introduction
وتستخدم على نطاق واسع تقنيات التضخيم Isothermal للكشف عن الأحماض النووية. بالمقارنة مع النهج التقليدية PCR التي تتطلب التربيع الحراري، والتضخيم isothermal يسمح تضخيم الحمض النووي أن يحدث في درجة حرارة واحدة، وبالتالي تمكين أسرع الوقت إلى النتائج والتسامح أفضل منمثبطات 1،2. فائدة رئيسية أخرى من التضخيم isothermal هو انخفاض تعقيد الأجهزة. معظم تفاعلات التضخيم isothermal تتطلب فقط كتلة الحرارة والكشف عن طريقة إما في الوقت الحقيقي عن طريق رصد الفلورية أو الكشف عن نقطة النهاية، على سبيل المثال عن طريق التدفق الجانبي أو هلام electrophoresis3،4. يتم إنجاز الكشف عن الفلورسينس في الوقت الحقيقي من خلال الكشف عن الفلورسينس التي تنتجها الأصباغ المتشابكة التي تنشط في وجود الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل أو مسابير الفلورسنت المروية التي تنشط في وجود تسلسل الحمض النووي المحدد المزدوج الذين تقطعت بهم السبل.
في حين أن تتوفر تجاريا benchtop isothermal الفلورية موجودة ، وكثير من عدم التخصيص لتنفيذ المقايسة. على سبيل المثال، تتطلب العديد من الأجهزة المواد الاستهلاكية المحددة أو التي توفرها الشركة، أو توصي البائعين المفضلين، أو تستخدم برامج خاصة للحصول على النتائج المعلن عنها. وتكلف معظم هذه النظم أكثر من 000 5 دولار أمريكي، مما يمثل حاجزا كبيرا أمام الاستخدام الواسع النطاق في البيئات المحدودة الموارد. وبالإضافة إلى ذلك، يواجه المستخدمون في البيئات منخفضة الموارد تحديات في صيانة المعدات المصممة لبيئات الموارد العالية بسبب الظروف البيئية القاسية، وضعف سلاسل التوريد لقطع الغيار، والأدوات المتخصصة اللازمة للصيانة والإصلاح5. لتلبية هذه الحاجة، وصفها هنا هو تصميم وتجميع وحدات ومنخفضة التكلفة الفلوريمتر شيدت من المكونات الجاهزة المغلقة في السكن المطبوعة 3D المدمجة (الشكل 1A–C) مع اثنين من التكوينات الاختيارية. يستخدم التكوين الأول لهذا الجهاز مرشحات زجاجية متاحة تجاريا ومرآة ديكهروبيك لمنع ضوء الخلفية الزائد وتبلغ التكلفة الإجمالية للتجميع 830 دولارا أمريكيا. في حين أن هذه المرشحات تستخدم عادة في أنظمة التصوير القائمة على الفلورسينس ، فإن استبدال رقائق التصفية البصرية عالية الجودة باهظة الثمن قد ثبت سابقا أنه يسمح بالكشف عن الحمض النووي6. التكوين الثاني من الفلوريمتر يتضمن هذه المرشحات غير مكلفة ويستبدل المرايا ديكهروي مع φ1/2 “شعاع التقسيمات, خفض التكلفة الإجمالية للنظام من $830 إلى $450 USD.
يتم عرض الصور التمثيلية للتكوين الأول في الشكل 1 والشكل 2، ولكن يمكن العثور على صور مماثلة للتكوين الثاني في الملف التكميلي 6. ولتجنب الحاجة إلى محاذاة بصرية متخصصة، حدد النظام البصري مناطق لوضع كل مكون بصري ويمكن صنعها بطابعة ثلاثية الأبعاد منخفضة نسبيا، مما يسمح بالاستخدام الواسع النطاق للتصميم. الاختلافات الوحيدة في البناء والتجميع للتكوينين هي الملفات المستخدمة للطباعة ثلاثية الأبعاد والمكونات البصرية الموضوعة في الحاوية. الأبعاد الخارجية للعلبة المطبوعة ثلاثية الأبعاد لكلا النظامين هي نفسها. وتظهر مقارنة تكلفة النظامين في الجدول 1.
كما هو مبين في الشكل 1A، للحفاظ على عامل شكل صغير ، يتكون الفلوريمتر من البصريات Φ1 /2 ” (~ 12.5 مم) ، إلى جانب الإضاءة المدمجة والكشف التي يتم وضعها لقياس الإشارة من خلال الجزء العلوي من أنبوب PCR. تم تصميم النظام في الشكل 1 للكشف عن الأصباغ مع ذروة الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات بالقرب من 490 نانومتر و 525 نانومتر، على التوالي، بما في ذلك FITC والأصباغ ذات الصلة الوثيقة مثل SYBR و SYTO-9، والتي تستخدم عادة كمراسلين في الوقت الحقيقي تفاعلات تضخيم حمض النيوكليك7،8. مصدر الإثارة، والمرشحات البصرية، وكاشف يمكن بسهولة أن تحل محل المكونات المتوافقة مع الأصباغ الفلورية المختلفة على النحو المطلوب. وعادة ما يتم تنفيذ تفاعلات تضخيم الحمض النووي في أنابيب PCR، وقد تم تصميم الفلورمتر ليتم وضعه فوق أي كتلة حرارية متاحة تجاريا تحمل أنابيب PCR(الشكل 1D)مما يسمح بمراقبة التفاعلات الحرارية في الوقت الحقيقي. تتوفر كتل الحرارة المناسبة في معظم مختبرات الطب الحيوي ويمكن شراؤها بأقل من 500 دولار أمريكي.
وقد ثبت في السابق استخدام أجهزة الكمبيوتر ذات اللوح الواحد لتوفير بديل منخفض التكلفة ونقطة رعاية للتحكم في تقنيات التصوير9. بناء على هذا العمل ، في هذا البروتوكول واجهة مستخدم رسومية واحدة تعمل بالكمبيوتر(الشكل 1D)يستخدم لتسهيل تسجيل البيانات في الوقت الحقيقي وعرض النتائج عند نقطة الرعاية ، مما يلغي الحاجة إلى جهاز كمبيوتر محمول لمعالجة البيانات أو تصورها. ونقلت قياسات الفلورسينس من خلال بروتوكول I2C من أجهزة استشعار الضوء إلى متحكم دقيق، ثم أتيحت للكمبيوتر أحادي اللوح من خلال الاتصالات التسلسلية. وتم توفير وصلات كهربائية للإضاءة ونقل البيانات من خلال أسلاك مبسطة وحام على ألواح الخبز المصغرة، مما ينفي الحاجة إلى لوحات دوائر مطبوعة متخصصة. البرنامج المطلوب لتشغيل الفلوريمتر متاح من خلال أطر البرمجيات مفتوحة المصدر ويتم توفير التعليمات البرمجية المطلوبة لتشغيل الجهاز في ملفات الترميز التكميلية. يمكن تجميع الفلوريمتر الكامل مقابل ما بين 450 إلى 830 دولارا أمريكيا ، وتظهر النتائج أنه يوفر قياسات مفلورة دقيقة وموثوقة لمراقبة التضخيم الحراري الحقيقي للأحماض النووية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الموصوف هنا هو مفتوح المصدر، منخفضة التكلفة، وحدات، مضاد المحمولة للكشف عن الفلورية الكمية من تفاعلات التضخيم isothermal. تسهل المشاريع المفتوحة المصدر الصيانة السريعة وغير المكلفة مع قطع الغيار المتاحة بسهولة وتتيح للمستخدمين المرونة لتكييف النظام مع احتياجاتهم على أساس التصميم المعياري. يصف هذا البروتوكول عملية تجميع المكونات الميكانيكية والبصرية والكهربائية، والتحقق من الأداء البصري. وعلاوة على ذلك، أظهرت مرونة الفلوريمتر لرصد نوعين مختلفين من المقايسات التضخيم isothermal مع درجة حرارة مختلفة إلى حد كبير، وحجم، ومتطلبات الفلورسينس، RPA exo وRT-مصباح. يتم تنفيذ RPA عند 39 درجة مئوية في 50 تفاعلات ميكرولتر التي تستخدم مسبارا موسوما ب FAM محدد التسلسل لتوليد الفلورسينس ، في حين يتم تنفيذ RT-LAMP عند 65 درجة مئوية في حجم تفاعل 25 ميكرولتر ويستخدم صبغة متداخلة للإبلاغ عن وجود الحمض النووي المضخم. ولأن قياسات الفلورسينس تتم من خلال الجزء العلوي من أنابيب PCR ذات القبعات المسطحة، فإن مقياس الفلورمتر قادر على اكتشاف الفلورسينس من كلا حجمي المقايسة، ومتطلبات الحرارة محدودة فقط من خلال كتلة الحرارة التجارية المختارة. وعلاوة على ذلك، فإن كثافة الفلورسينس المنتجة في RT-LAMP هي تقريبا في ترتيب حجم أكبر من تلك التي تنتج في الجيش الوطني الرواندي، وذلك بسبب أساليب الصباغة مقابل التحقيق القائم على توليد إشارة مضان. ومع ذلك ، فإن النطاق الديناميكي للمستشعر البصري المختار يمكن الكشف عن كل من الإشارات وتحديدها كميا ، وخوارزميات الطرح الأساسية مسؤولة عن هذه الاختلافات لإنتاج قراءات مضان موثوق بها.
ولتيسير نشر التكنولوجيا وتقليل تكاليف الصيانة المحتملة، استخدم تصميم نمطي يتوافق مع السخانات المتاحة على نطاق واسع في بيئات مختلفة. وفي البروتوكول الحالي، استخدم سخان كتلة جافة مشترك؛ ويمكن تكييف نفس التصميم البصري والكهربائي بسهولة لسخانات أخرى متاحة تجاريا. إذا كان آخر سخان كتلة جافة لاستخدامها، وسوف تكون هناك حاجة إلى تغييرات طفيفة في تصميم الإسكان 3D. على وجه التحديد، يجب تعديل أوتاد أسفل ملفات STL الضميمة البصرية لضمان المواءمة المناسبة مع آبار الكتل الحرارية التجارية الأخرى. بينما تمت طباعة المرفقات المعروضة في الأمثلة على طابعة ثلاثية الأبعاد منخفضة الوضوح نسبيا (انظر جدول المواد)،يجب الحرص على ضمان أن تكون دقة الطابعة و/أو تفاوت الطباعة ملائمة لاستيعاب المكونات البصرية والإدراجات المترابطة. في ملفات STL المتوفرة، تمت إضافة تفاوت 0.01-0.02 بوصة على جانبي المكونات البصرية في الاتجاهين الشعاعي والماكسي استنادا إلى الأبعاد المحددة من قبل الشركة المصنعة. وهذا يضمن احتواء جميع المكونات البصرية بشكل آمن داخل الطباعة وأن العلبة تمنع الضوء الزائد تماما من الدخول أو الهروب. لضمان ملائمة ضغط مناسب لإدراج مترابطة، تم طرح التسامح مماثلة من 0.01-0.02 بوصة من قطر الشركة المصنعة المتوفرة في ملف CAD.
تم رصد تفاعلات RPA بنجاح باستخدام تكوين الفلوريمتر الأول ، في حين يمكن مراقبة تفاعلات RT-LAMP باستخدام أي من التكوينين. كان الرفض الخفيف الضال المحسن للتكوين الأول ضروريا لمراقبة المستويات المنخفضة من الفلورسينس التي ينتجها المسبار الفلوري في ردود فعل الجيش الوطني الرواندي. وعلى النقيض من ذلك، يستخدم RT-LAMP صبغة متداخلة لتوليد الإشارات، مما يؤدي إلى كثافة مضان أعلى تتوافق مع النطاق الديناميكي الأدنى للتكوين الثاني باستخدام رقائق فلتر التصوير الفوتوغرافي. يجب على المستخدمين تحديد تكوين الفلوريمتر الذي يطابق إشارة الفلورسينس التي تولد صبغة متداخلة العناصر أو مسبار فلوري من المقايسة الخاصة بهم.
أحد قيود هذا النظام هو أن يتم توفير التدفئة عن طريق كتلة الحرارة المتاحة تجاريا تعمل بالطاقة من خلال منفذ الجدار القياسية. ويمكن مواصلة تطوير هذا النظام لاستخدامه في المناطق التي تفتقر إلى إمكانية الحصول على الكهرباء عن طريق دمج حزم البطاريات المحمولة وال قابلة لإعادة الشحن كما هو مبين في المجموعات الأخرى12. وثمة قيد آخر هو الإنتاجية المنخفضة نسبيا للنظام، الذي يسمح بقياس الفلورسينس المتزامن لعينتين فقط في كل مرة. يمكن وضع مطبوعات متعددة من الضميمة فوق كتلة الحرارة نفسها لزيادة الإنتاجية؛ ومع ذلك ، فإن استشعار الضوء المستخدمة لديها أربعة عناوين فريدة من نوعها أنا2C. وهذا يقيد الحد الأقصى لعدد العينات التي يمكن قياسها في وقت واحد إلى أربعة. هناك حاجة إلى مستشعر ضوء مختلف مع عدد أكبر من عناوين I2C الفريدة لزيادة الإنتاجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر خاص لتشيلسي سميث، ميغان تشانغ، إميلي نيوشام، ساي بول، وكريستوفر جوه لمساعدتهم في إعداد العينة. يشكر المؤلفون كارولين نوسون على مراجعة المخطوطات. وقد قدمت الوكالة الأميركية للتنمية الدولية التمويل لهذا العمل من الشعب الأمريكي من خلال منحة بحثية من التحالف العالمي للقاحات والتحصين CCID 9204 بموجب جائزة AID-OAA-A16-00032 بين التحالف ووكالة التنمية الدولية التابعة للولايات المتحدة.
Materials
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED – 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
References
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
