Análise sistemática de pontuação para inflamação intestinal em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio murine dextran
Summary
A pontuação sistemática da inflamação intestinal usando um sistema gratuito assistido por computador é uma ferramenta poderosa para comparar quantitativamente alterações histopatológicas em modelos de colite caracterizados pela presença de úlceras e alterações inflamatórias. A avaliação do escore da colite histológica fortalece as observações clínicas e facilita a interpretação dos dados.
Abstract
Os modelos de colite murina são ferramentas que são amplamente empregadas em estudos focados na compreensão da patobiologia de distúrbios intestinais inflamatórios. No entanto, ainda não se devem definir normas robustas para quantificação objetiva e reprodutível da gravidade da doença. A maioria dos métodos de análise de colites baseia-se na pontuação histológica limitada de pequenos segmentos do intestino, levando a análises parciais ou tendenciosas. Aqui, combinamos aquisição de imagem de alta resolução e análise longitudinal de todo o cólon para quantificar lesões intestinais e ulceração no modelo induzido de sulfato de sódio dextran (DSS) de colite murina. Este protocolo permite a geração de resultados objetivos e reprodutíveis sem um extenso treinamento de usuários. Aqui, fornecemos detalhes abrangentes sobre a preparação da amostra e a análise de imagens usando exemplos de dados da colite induzida pelo DSS. Este método pode ser facilmente adaptado a outros modelos de colite murina que têm inflamação significativa associada à lesão mucosa. Demonstramos que a fração de mucosa inflamada/ferida e erodida/ulcerada em relação ao comprimento completo do cólon faz um paralelo com os achados clínicos, como a perda de peso em meio à progressão da doença induzida pelo DSS. Este protocolo histológico fornece um tempo confiável e um auxílio econômico para padronizar as análises da atividade da doença de forma imparcial nos experimentos de colite do DSS.
Introduction
A barreira epitelial gastrointestinal desempenha um papel fundamental na separação de antígenos luminosos e patógenos dos compartimentos de tecidosubjacentes 1. Lesões epiteliais e feridas mucosas observadas em condições patológicas como doença inflamatória intestinal (DII), isquemia ou lesão cirúrgica estão associadas a sintomas clínicos que incluem diarreia, perda de peso, sangue nas fezes e dor abdominal. Em resposta à lesão, as células epiteliais migram e proliferam para re-epitelializar e reparar defeitos da barreira mucosa. Resolução de inflamação e restituição da integridade mucosa são cruciais para restabelecer a homeostase e a função mucosa intestinal2,3,4.
Vários modelos animais têm sido empregados para estudar os mecanismos moleculares subjacentes que estão associados com os danos à barreira epitelial intestinal. Modelos bem estabelecidos e facilmente aplicáveis de colite quimicamente induzida são amplamente utilizados, particularmente em estudos relacionados a lesões inflamatórias como o DII. Um modelo comum, reprodutível e confiável de colite murina emprega sulfato de sódio dextran (DSS) mediado lesão cólon e inflamação. A gravidade da doença varia dependendo da cepa do camundongo, dose de DSS, comprimento da administração do DSS e peso molecular de DSS5,6,7.
O dano mucosa intestinal durante a colite DSS é geralmente avaliado usando o Índice de Atividade da Doença (DAI), um escore composto determinado pela perda de peso, conteúdo sanguíneo fecal e consistência das fezes. O teor de sangue fecal pode ser microscópico (detectado usando um teste de ácido guaiaco) ou macroscópico; a consistência fecal é classificada como dura, macia ou líquida (ou seja, diarreia)5,8. A pontuação desses parâmetros clínicos pode ser subjetiva e pode variar dependendo da experiência e viés do usuário, embora, no geral, os dados forneçam informações confiáveis e, portanto, amplamente utilizados pelos pesquisadores do IBD. Em contraste, não há um método geralmente aceito para avaliação histológica de danos mucosos. Mais comumente, as áreas selecionadas do cólon são inspecionadas por um patologista treinado e pontuadas com base em vários parâmetros que geralmente incluem lesão cripíplica e infiltração de leucócitos9,10,11. No entanto, como o número de parâmetros investigados e a quantidade de tecido analisado varia consideravelmente entre os relatórios individuais, a comparabilidade de muitos estudos publicados é limitada. Para reduzir o viés do observador e melhorar a concordância entre estudos, um protocolo de pontuação histológica ideal deve: 1) incluir toda a extensão do cólon, uma vez que a inflamação mucosa intestinal é mais frequentemente variável e as lesões de salto são comuns, 2) limitar a análise a parâmetros específicos de chave e facilmente interpretáveis para reduzir a subjetividade, 3) facilitar o processamento rápido e consistente de grandes números de amostras e 4) usar ferramentas amplamente disponíveis e acessíveis para aquisição, análise e apresentação de dados.
Aqui descrevemos uma técnica para processar todo o cólon ou segmentos longos do intestino delgado em uma configuração de “rolo suíço”, juntamente com o uso de um sistema gratuito de pontuação assistida por computador para analisar inflamação e dano mucosal intestinal por causa de colite induzida pelo DSS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso sistema de pontuação de colitis histológica constitui uma ferramenta confiável para quantificar inflamação tecidual e danos no intestino. Essa abordagem proporciona uma melhor compreensão do estado histopatológico de todo o órgão sem o viés de seleção de pequenas áreas ou seções incompletas. Entre as etapas críticas para executar com sucesso este protocolo estão a preparação adequada dos rolos suíços que permitem a análise de pelo menos 90% do comprimento do cólon; orientação paralela dura…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam reconhecer o apoio do financiamento do NIH DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 e dos Serviços de Varredura de Slides da Patologia da Universidade de Michigan.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
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