Analisi sistematica del punteggio per l'infiammazione intestinale in un modello di colite indotta da solfato di sodio di Murine
Summary
Il punteggio sistematico dell’infiammazione intestinale utilizzando un sistema assistito da computer gratuito è un potente strumento per confrontare quantitativamente i cambiamenti istopatologici nei modelli di colite caratterizzati dalla presenza di ulcere e cambiamenti infiammatori. La valutazione del punteggio della colite istologica rafforza le osservazioni cliniche e facilita l’interpretazione dei dati.
Abstract
I modelli di colite murina sono strumenti ampiamente utilizzati in studi incentrati sulla comprensione della patobiologia dei disturbi intestinali infiammatori. Tuttavia, restano da definire standard solidi per una quantificazione obiettiva e riproducibile della gravità della malattia. La maggior parte dei metodi di analisi della colite si basano su un punteggio istologico limitato di piccoli segmenti dell’intestino, portando ad analisi parziali o parziali. Qui, combiniamo l’acquisizione di immagini ad alta risoluzione e l’analisi longitudinale dell’intero colon per quantificare la lesione intestinale e l’ulcerazione nel modello indotto dal solfato di sodio di dextran (DSS) della colite murina. Questo protocollo consente la generazione di risultati oggettivi e riproducibili senza un’ampia formazione degli utenti. Qui, forniamo dettagli completi sulla preparazione del campione e sull’analisi delle immagini utilizzando esempi di dati della colite indotta da DSS. Questo metodo può essere facilmente adattato ad altri modelli di colite murina che hanno un’infiammazione significativa associata a lesioni della mucosa. Dimostriamo che la frazione di mucosa infiammata/ ferita e erosa / ulcerata rispetto alla lunghezza completa del colon è strettamente parallela ai risultati clinici come la perdita di peso in mezzo alla progressione della malattia indotta dal DSS. Questo protocollo istologico fornisce un aiuto affidabile in termini di tempo ed economico per standardizzare le analisi dell’attività della malattia in modo imparziale negli esperimenti di colite DSS.
Introduction
La barriera epiteliale gastrointestinale svolge un ruolo fondamentale nel separare gli antigeni luminali e gli agenti patogeni dai compartimenti tissutalisottostanti 1. Lesioni epiteliali e ferite mucose osservate in condizioni patologiche come malattia infiammatoria intestinale (IBD), ischemia o lesioni chirurgiche sono associate a sintomi clinici che includono diarrea, perdita di peso, sangue nelle feci e dolore addominale. In risposta alle lesioni, le cellule epiteliali migrano e proliferano per er epitelializzare e riparare i difetti della barriera della mucosa. La risoluzione dell’infiammazione e la restituzione dell’integrità della mucosa sono fondamentali per ristabiliscono l’omeostasi della mucosa intestinalee la funzione 2,3,4.
Vari modelli animali sono stati utilizzati per studiare i meccanismi molecolari sottostanti associati al danno alla barriera epiteliale intestinale. Modelli consolidati e facilmente applicabili di colite indotta chimicamente sono ampiamente utilizzati, in particolare negli studi relativi a lesioni infiammatorie come l’IBD. Un modello comune, riproducibile e affidabile di colite murina utilizza lesioni e infiammazioni del solfato di sodio di dextran (DSS). La gravità della malattia varia a seconda dello sforzo del topo, della dose di DSS, della lunghezza della somministrazione di DSS e del peso molecolare di DSS5,6,7.
Il danno mucoso intestinale durante la colite DSS viene solitamente valutato utilizzando l’indice di attività della malattia (DAI), un punteggio composito determinato dalla perdita di peso, dal contenuto di sangue fecale e dalla consistenza delle feci. Il contenuto di sangue fecale può essere microscopico (rilevato utilizzando un test dell’acido guaiaco delle feci) o macroscopico; la consistenza fecale è classificata come dura, morbida o liquida (cioè diarrea)5,8. Il punteggio di questi parametri clinici può essere soggettivo e può variare a seconda dell’esperienza e della distorsione dell’utente, anche se nel complesso, i dati forniscono informazioni affidabili ed è quindi ampiamente utilizzato dai ricercatori IBD. Al contrario, non esiste un metodo generalmente accettato per la valutazione istologica dei danni alla mucosa. Più comunemente, le aree selezionate del colon vengono ispezionate da un patologo addestrato e valutate sulla base di diversi parametri che di solito includono lesioni alla cripta e infiltrazione di leucociti9,10,11. Tuttavia, poiché il numero di parametri studiati e la quantità di tessuto analizzato variano considerevolmente tra i singoli rapporti, la comparabilità di molti studi pubblicati è limitata. Per ridurre la distorsione dell’osservatore e migliorare la concordanza inter-studio, un protocollo di punteggio istologico ideale dovrebbe: 1) includere l’intera lunghezza del colon, poiché l’infiammazione della mucosa intestinale è più spesso variabile e le lesioni skip sono comuni, 2) limitare l’analisi a parametri chiave specifici e facilmente interpretabili per ridurre la soggettività, 3) facilitare un’elaborazione rapida e coerente di un gran numero di campioni e 4) utilizzare strumenti ampiamente disponibili e convenienti per l’acquisizione, l’analisi e la presentazione dei dati.
Qui descriviamo una tecnica per elaborare l’intero colon o i segmenti lunghi dell’intestino tenue in una configurazione “swiss roll” insieme all’uso di un sistema di punteggio assistito da computer gratuito per analizzare l’infiammazione e i danni della mucosa intestinale a causa della colite indotta da DSS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro sistema di punteggio di colite istologica costituisce uno strumento affidabile per quantificare l’infiammazione e i danni dei tessuti nell’intestino. Questo approccio fornisce una migliore comprensione dello stato istopatologico dell’intero organo senza la tendenza a selezionare piccole aree o sezioni incomplete. Tra le fasi critiche per eseguire con successo questo protocollo ci sono la corretta preparazione dei rotoli svizzeri che consentono l’analisi di almeno il 90% della lunghezza dei due punti; orientamen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il supporto del finanziamento NIH DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 e dell’Università del Michigan Pathology Slide Scanning Services.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
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