Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

O fracionamento subcelular é um procedimento no qual as células são lisadas e separadas em seus componentes constituintes através de vários métodos. Esta técnica pode ser usada por pesquisadores para determinar a localização de proteínas em células de mamíferos ou para o enriquecimento de proteínas de baixa abundância que, de outra forma, seriam indetectáveis. Embora existam atualmente métodos de fracionamento subcelular, assim como os kits comerciais que podem ser adquiridos, eles sofrem de várias limitações que esse procedimento tenta superar. A maioria dos métodos de fracionamento celular é exclusivamente à base de detergente^1,2, contando com o uso de tampões contendo quantidades crescentes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Embora este método seja rápido e conveniente, resulta em frações impuras. Estes são projetados para permitir que os pesquisadores isolem facilmente um ou dois componentes da célula, mas não são complexos o suficiente para isolar múltiplas frações subcelulares de uma amostra ao mesmo tempo. Depender apenas de detergentes geralmente resulta em organelas fechadas por membrana e a membrana plasmática sendo indiscriminadamente solubilizada, dificultando a separação desses componentes. Uma complicação adicional do uso desses kits é a incapacidade dos pesquisadores de alterá-los / otimizá-los para aplicações específicas, já que a maioria dos componentes são formulações proprietárias. Finalmente, esses kits podem ser proibitivamente caros, com limitações no número de usos que os tornam menos do que ideais para amostras maiores.

Apesar da disponibilidade de kits para o isolamento de mitocôndrias que não dependem de detergentes, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e produzir quantidades significativamente menores de amostra do que os protocolos de isolamento padrão ^3,4. Embora os métodos de centrifugação diferenciais sejam mais demorados, eles geralmente resultam em frações distintas que não podem ser obtidas com kits exclusivamente à base de detergente¹. A separação sem o uso exclusivo de detergentes solubilizantes também permite uma purificação adicional usando ultracentrifugação e gradientes de densidade isopícnica, resultando em menos contaminação cruzada. Este protocolo de fracionamento demonstra o isolamento de frações subcelulares dos monócitos U937 usando uma combinação de abordagens baseadas em detergente e centrífuga de alta velocidade. Este método facilitará o isolamento dos componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriais e da membrana plasmática de uma célula de mamíferos com contaminação mínima entre as frações.