Frazionamento cellulare di cellule U937 mediante purificazione del gradiente di densità isopicnica

Il frazionamento subcellulare è una procedura in cui le cellule vengono lisate e separate nei loro componenti costitutivi attraverso diversi metodi. Questa tecnica può essere utilizzata dai ricercatori per determinare la localizzazione delle proteine nelle cellule di mammifero o per l’arricchimento di proteine a bassa abbondanza che altrimenti non sarebbero rilevabili. Mentre attualmente esistono metodi per il frazionamento subcellulare, così come i kit commerciali che possono essere acquistati, soffrono di diverse limitazioni che questa procedura tenta di superare. La maggior parte dei metodi di frazionamento cellulare sono esclusivamente a base di detergente^1,2, basandosi sull’uso di tamponi contenenti quantità crescenti di detergente per solubilizzare diversi componenti cellulari. Mentre questo metodo è rapido e conveniente, si traduce in frazioni impure. Questi sono progettati per consentire ai ricercatori di isolare facilmente uno o due componenti della cellula, ma non sono abbastanza complessi da isolare più frazioni subcellulari da un campione allo stesso tempo. Affidarsi esclusivamente ai detergenti di solito si traduce in organelli chiusi in membrana e la membrana plasmatica solubilizzata indiscriminatamente, rendendo difficile la separazione di questi componenti. Un’ulteriore complicazione derivante dall’uso di questi kit è l’incapacità dei ricercatori di modificarli / ottimizzarli per applicazioni specifiche, poiché la maggior parte dei componenti sono formulazioni proprietarie. Infine, questi kit possono essere proibitivamente costosi, con limitazioni nel numero di usi che li rendono meno ideali per campioni più grandi.

Nonostante la disponibilità di kit per l’isolamento dei mitocondri che non si basano su detergenti, non sono progettati per isolare la membrana plasmatica e produrre quantità significativamente inferiori di campione rispetto ai protocolli di isolamento standard ^3,4. Mentre i metodi di centrifugazione differenziale richiedono più tempo, spesso si traducono in frazioni distinte che non possono essere ottenute con kit esclusivamente a base di detergenti¹. La separazione senza il solo uso di detergenti solubilizzanti consente anche un’ulteriore purificazione utilizzando ultracentrifugazione e gradienti di densità isopicnica, con conseguente minore contaminazione incrociata. Questo protocollo di frazionamento dimostra l’isolamento delle frazioni subcellulari dai monociti U937 utilizzando una combinazione di approcci basati su detergenti e centrifugazione ad alta velocità. Questo metodo faciliterà l’isolamento dei componenti nucleari, citoplasmatici, mitocondriali e della membrana plasmatica di una cellula di mammifero con una contaminazione minima tra le frazioni.