Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

Subzelluläre Fraktionierung ist ein Verfahren, bei dem Zellen lysiert und durch verschiedene Methoden in ihre Bestandteile getrennt werden. Diese Technik kann von Forschern verwendet werden, um die Proteinlokalisierung in Säugetierzellen zu bestimmen oder Proteine mit geringer Abundanz anzureichern, die sonst nicht nachweisbar wären. Während es derzeit Methoden zur subzellulären Fraktionierung gibt, ebenso wie kommerzielle Kits, die erworben werden können, leiden sie unter mehreren Einschränkungen, die dieses Verfahren zu überwinden versucht. Die meisten Zellfraktionierungsmethoden basieren ausschließlich auf Detergenzien^1,2 und basieren auf der Verwendung von Puffern^, die zunehmende Mengen an Detergens enthalten, um verschiedene zelluläre Komponenten zu lösen. Während diese Methode schnell und bequem ist, führt sie zu unreinen Fraktionen. Diese sind so konzipiert, dass Forscher eine oder zwei Komponenten der Zelle leicht isolieren können, sind aber nicht komplex genug, um mehrere subzelluläre Fraktionen gleichzeitig aus einer Probe zu isolieren. Sich ausschließlich auf Reinigungsmittel zu verlassen, führt in der Regel dazu, dass membranumschlossene Organellen und die Plasmamembran wahllos gelöst werden, was die Trennung dieser Komponenten erschwert. Eine zusätzliche Komplikation durch die Verwendung dieser Kits ist die Unfähigkeit der Forscher, sie für bestimmte Anwendungen zu ändern / zu optimieren, da die meisten Komponenten proprietäre Formulierungen sind. Schließlich können diese Kits unerschwinglich teuer sein, mit Einschränkungen in der Anzahl der Anwendungen, die sie für größere Proben nicht ideal machen.

Trotz der Verfügbarkeit von Kits für die Isolierung von Mitochondrien, die nicht auf Detergenzien angewiesen sind, sind sie nicht für die Isolierung der Plasmamembran ausgelegt und liefern signifikant geringere Probenmengen als Standard-Isolierungsprotokolle ^3,4. Während differentielle Zentrifugationsmethoden zeitaufwendiger sind, führen sie oft zu unterschiedlichen Fraktionen, die mit ausschließlich waschmittelbasierten Kits nicht erhalten werden können¹. Die Trennung ohne alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien ermöglicht auch eine weitere Reinigung mittels Ultrazentrifugation und isopyknischen Dichtegradienten, was zu weniger Kreuzkontamination führt. Dieses Fraktionierungsprotokoll demonstriert die Isolierung subzellulärer Fraktionen aus U937-Monozyten unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien- und Hochgeschwindigkeitszentrifugationsansätzen. Diese Methode erleichtert die Isolierung der Kern-, Zytoplasma-, Mitochondrien- und Plasmamembrankomponenten einer Säugetierzelle mit minimaler Kontamination zwischen den Fraktionen.