Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique

Le fractionnement subcellulaire est une procédure dans laquelle les cellules sont lysées et séparées en leurs composants constitutifs par plusieurs méthodes. Cette technique peut être utilisée par les chercheurs pour déterminer la localisation des protéines dans les cellules de mammifères ou pour enrichir des protéines de faible abondance qui seraient autrement indétectables. Bien qu’il existe actuellement des méthodes de fractionnement subcellulaire, tout comme les kits commerciaux qui peuvent être achetés, ils souffrent de plusieurs limitations que cette procédure tente de surmonter. La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire sont exclusivement à base de détergent^1,2, reposant sur l’utilisation de tampons contenant des quantités croissantes de détergent pour solubiliser différents composants cellulaires. Bien que cette méthode soit rapide et pratique, elle aboutit à des fractions impures. Ceux-ci sont conçus pour permettre aux chercheurs d’isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais ne sont pas assez complexes pour isoler plusieurs fractions subcellulaires d’un échantillon en même temps. Se fier uniquement aux détergents entraîne généralement une solubilisation indiscriminée des organites enfermés dans la membrane et de la membrane plasmique, ce qui rend la séparation de ces composants difficile. Une complication supplémentaire de l’utilisation de ces kits est l’incapacité des chercheurs à les modifier/optimiser pour des applications spécifiques, car la plupart des composants sont des formulations exclusives. Enfin, ces kits peuvent être d’un coût prohibitif, avec des limites dans le nombre d’utilisations qui les rendent moins qu’idéaux pour des échantillons plus volumineux.

Malgré la disponibilité de kits pour l’isolement des mitochondries qui ne dépendent pas de détergents, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et produire des quantités d’échantillon significativement inférieures aux protocoles d’isolement standard ^3,4. Bien que les méthodes de centrifugation différentielle prennent plus de temps, elles aboutissent souvent à des fractions distinctes qui ne peuvent pas être obtenues avec des kits exclusivement à base de détergent¹. La séparation sans utilisation exclusive de détergents solubilisants permet également une purification supplémentaire à l’aide d’ultracentrifugation et de gradients de densité isopycnique, ce qui réduit la contamination croisée. Ce protocole de fractionnement démontre l’isolement de fractions subcellulaires à partir de monocytes U937 en utilisant une combinaison d’approches basées sur la centrifugation à haute vitesse et les détergents. Cette méthode facilitera l’isolement des composants nucléaires, cytoplasmiques, mitochondriaux et plasmiques d’une cellule de mammifère avec une contamination minimale entre les fractions.