Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli
Summary
Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.
Abstract
Viral enfeksiyonlar sırasında nazal epitel tabakası ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki erken etkileşimler henüz keşfedilmemiş bir alan olmaya devam etmektedir. Viral enfeksiyonlarda doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyonunun önemi, yüksek doğuştan gelen T hücresi aktivasyonu sergileyen solunum yolu enfeksiyonlu hastalar daha iyi bir hastalık sonucu gösterdiğinden önemli ölçüde artmıştır. Bu nedenle, bu erken doğuştan gelen bağışıklık etkileşimlerini parçalara ayırmak, onları yöneten süreçlerin aydınlatılmasına izin verir ve viral enfeksiyonların erken ilerlemesini azaltmak veya hatta önlemek için potansiyel terapötik hedeflerin ve stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş hava yolu epitel hücreleri tarafından salgılanan faktörlerden doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin erken çapraz etkileşimini, etkileşimlerini ve aktivasyonunu incelemek için kullanılabilecek çok yönlü bir modeli detaylandırır. Temsili virüs modeli olarak bir H3N2 influenza virüsü (A / Aichi / 2 / 1968) kullanılarak, viral enfeksiyona yanıt olarak epitelden salınan çözünür faktörler tarafından aktive edilen hücrelerin alt kümelerini araştırmak için ko-kültürlü periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC’ler) doğuştan gelen hücre aktivasyonu analiz edilmiştir. Sonuçlar, hücrelerin alt kümelerini ayırt etmek için geçit stratejisini göstermektedir ve PBMC’lerin aktive olmuş popülasyonları ile kontrol ve enfekte epitel ile çapraz etkileşimleri arasındaki açık farklılıkları ortaya koymaktadır. Aktive edilen alt kümeler daha sonra fonksiyonlarını ve hücrelere özgü moleküler değişiklikleri belirlemek için daha fazla analiz edilebilir. Böyle bir çapraz konuşma araştırmasından elde edilen bulgular, viral enfeksiyonun ilerlemesini kontrol etmede ve bastırmada yararlı olan hayati doğuştan gelen hücre popülasyonlarının aktivasyonu için önemli olan faktörleri ortaya çıkarabilir. Dahası, bu faktörler evrensel olarak farklı viral hastalıklara, özellikle de yeni ortaya çıkan virüslere, bu tür virüslerin naif insan popülasyonlarında ilk dolaşıma girdiklerinde etkilerini azaltmak için uygulanabilir.
Introduction
Solunum yolu virüsleri belki de ciddi sağlık ve ekonomik yüke neden olan en yaygın patojenler arasındadır. Ortaya çıkan salgın suşların (örneğin, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) periyodik küresel salgınlarından, her yıl mevsimsel grip suşlarına kadar, virüsler halk sağlığı için sürekli bir tehdittir. Her ne kadar aşılar bu küresel halk sağlığı sorunlarına verilen yanıtın ana kütlesini oluştursa da, bu karşı önlemlerin sadece 1,2’ye yanıt verdiğini belirtmek ayıltıcıdır. Ayrıca, yeni bir bulaşıcı suşun ortaya çıkması ile aşısının başarılı bir şekilde geliştirilmesi arasındaki gecikme kaçınılmazdır3 ve virüsün yayılmasını engellemek için mevcut önlemlerin oldukça sınırlı olduğu bir döneme yol açmaktadır.
Bu gecikmeler, ekonomik ve sosyal olarak topluma uygulanan maliyetlerle daha da vurgulanmaktadır. Sadece mevsimsel grip, dolaylı maliyetlerde yaklaşık 8 milyar dolardan, tıbbi maliyetlerde 3,2 milyar dolardan ve Amerika Birleşik Devletleri’nde yılda 36,3 bin ölümden sorumludur4. Bu, aşı geliştirmeyi finanse etmek için gerekli olan araştırma maliyetlerini dikkate almadan öncedir. Epidemik salgınlar, şiddetli akut solunum sendromu koronovirüs 2’nin (SARS-CoV-2) ortaya çıkması ve hızla yayılmasının neden olduğu küresel bozulmaların kanıtladığı gibi, her yıl artan küreselleşme hızıyla birleştiğinde, toplum üzerinde daha da ciddi etkilere sahiptir5,6,7.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, daha fazla aktive olmuş doğuştan gelen T hücresi popülasyonuna sahip enfekte hastaların daha iyi bir hastalık sonucuna sahip olma eğiliminde olduğunu göstermiştir 8,9,10. Ayrıca, doğuştan gelen T hücresi popülasyonu birden fazla alt gruba ayrılır: mukozal ilişkili değişmez T (MAIT) hücreleri, Vδ1 γδ T hücreleri, Vδ2 γδ T hücreleri ve doğal öldürücü T (NKT) hücreleri. Doğuştan gelen T hücrelerinin bu alt grupları da popülasyonlarında heterojenlik sergiler ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde yer alan hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını arttırır11. Bu nedenle, bu doğuştan gelen T hücrelerini aktive eden mekanizma ve doğuştan gelen T hücrelerinin spesifik alt gruplarının bilgisi, özellikle aşı geliştirme döneminde, bu virüslerin insan konakçısı üzerindeki bulaşıcı etkilerini azaltmak için farklı bir araştırma yolu sağlayabilir.
İnfluenza ile enfekte olmuş epitel hücreleri, doğuştan gelen T hücrelerini hızla aktive eden faktörler üretir12,13,14. Bu bulguya dayanarak, bu temassız Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) ortak kültür modeli, erken enfeksiyon sırasında enfekte burun epitel tabakası ile PBMC’ler arasındaki erken kimyasal etkileşimleri (enfekte epitel tabakası tarafından salınan çözünür faktörlerin aracılık ettiği) taklit etmeyi amaçlamaktadır. Nazal epitel tabakası (membran eklerinde kültürlenmiş) ve PBMC’ler (altındaki odada) arasındaki fiziksel ayrım ve epitel bütünlüğü, PBMC’lerin virüs tarafından doğrudan enfeksiyonunu önler ve epitel kaynaklı çözünür faktörlerin PBMC’ler üzerindeki etkilerinin ayrıntılı bir şekilde incelenmesini sağlar. Bu nedenle, tanımlanan faktörler, influenza enfeksiyonuna karşı koruyabilecek uygun doğuştan gelen T hücresi popülasyonunu indüklemede terapötik potansiyelleri açısından daha fazla araştırılabilir. Bu nedenle bu yazıda, epitel kaynaklı çözünür faktörlerden doğuştan gelen T-hücresi aktivasyonunun incelenmesi için bir ko-kültür oluşturma yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virüslere karşı doğuştan gelen immün yanıtlar, antiviral yönetimde az araştırılan bir çalışma alanıdır. Hava yolu epitel hücreleri ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bir enfeksiyon sırasında viral replikasyonu baskılamak için uyum içinde çalışır, ayrıca viral yük kontrol altında tutulmazsa aşırı aktif adaptif yanıtın belirleyicisi olarak hizmet eder12,13,17. Bununla birlikte, uygun …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NUS Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı’ndaki araştırma personeline, hNEC kültürü ve viral kültür ile ilgili çalışmalardaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Ulusal Üniversite Hastanesi, Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı’ndaki cerrahlara ve cerrahi ekibe, çalışma için gerekli hücre ve kan örneklerinin sağlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
Bu çalışma Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi, Singapur No tarafından finanse edilmiştir. NMRC / CIRG / 1458/2016 (De Yun Wang için) ve MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan’a). Kai Sen Tan, Avrupa Alerji ve Klinik İmmünoloji (EAACI) Araştırma Bursu 2019’dan burs desteği almaktadır.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
