نموذج الزراعة المشتركة الخالية من التلامس لدراسة تنشيط الخلايا المناعية الفطرية أثناء عدوى فيروس الجهاز التنفسي
Summary
يفصل هذا البروتوكول التحقيق في التفاعلات المبكرة بين الخلايا الظهارية الأنفية المصابة بالفيروس وتنشيط الخلايا الفطرية. يمكن تمييز المجموعات الفرعية الفردية من الخلايا المناعية بناء على تنشيطها استجابة للعدوى الفيروسية. ويمكن بعد ذلك إجراء مزيد من التحقيقات لتحديد آثارها على الاستجابات المبكرة المضادة للفيروسات.
Abstract
لا تزال التفاعلات المبكرة بين الطبقة الظهارية الأنفية والخلايا المناعية الفطرية أثناء الالتهابات الفيروسية منطقة غير مستكشفة. زادت أهمية إشارات المناعة الفطرية في الالتهابات الفيروسية بشكل كبير حيث أظهر المرضى الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي الذين يظهرون تنشيطا فطريا عاليا للخلايا التائية نتيجة أفضل للمرض. وبالتالي ، فإن تشريح هذه التفاعلات المناعية الفطرية المبكرة يسمح بتوضيح العمليات التي تحكمها وقد يسهل تطوير أهداف واستراتيجيات علاجية محتملة لتثبيط أو حتى منع التقدم المبكر للعدوى الفيروسية. يفصل هذا البروتوكول نموذجا متعدد الاستخدامات يمكن استخدامه لدراسة الأحاديث المتقاطعة المبكرة والتفاعلات وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية من العوامل التي تفرزها الخلايا الظهارية المصابة بمجرى الهواء الفيروسي. باستخدام فيروس الأنفلونزا H3N2 (A/Aichi/2/1968) كنموذج فيروسي تمثيلي، تم تحليل التنشيط الفطري للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المستزرع (PBMCs) باستخدام قياس التدفق الخلوي للتحقيق في المجموعات الفرعية للخلايا التي يتم تنشيطها بواسطة العوامل القابلة للذوبان التي يتم إطلاقها من الظهارة استجابة للعدوى الفيروسية. وتظهر النتائج استراتيجية البوابات للتمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا وتكشف عن الاختلافات الواضحة بين المجموعات المنشطة من PBMCs وحديثها المتبادل مع الظهارة الضابطة والمصابة. يمكن بعد ذلك تحليل المجموعات الفرعية المنشطة لتحديد وظائفها وكذلك التغيرات الجزيئية الخاصة بالخلايا. قد تكشف النتائج المستخلصة من مثل هذا التحقيق المتبادل عن عوامل مهمة لتنشيط مجموعات الخلايا الفطرية الحيوية ، والتي تكون مفيدة في السيطرة على تطور العدوى الفيروسية وقمعها. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه العوامل عالميا على الأمراض الفيروسية المختلفة، وخاصة على الفيروسات الناشئة حديثا، لتخفيف تأثير هذه الفيروسات عندما تنتشر لأول مرة في مجموعات بشرية ساذجة.
Introduction
ربما تكون فيروسات الجهاز التنفسي من بين مسببات الأمراض الأكثر انتشارا التي تسبب الرعاية الصحية الشديدة والعبء الاقتصادي. وتشكل الفيروسات، بدءا من الفاشيات العالمية الدورية للسلالات الوبائية الناشئة (مثل H1N1 وH5N1 وH3N2 وMERS وCOVID-19) إلى السلالات الموسمية للإنفلونزا كل عام، تشكل الفيروسات تهديدا مستمرا للصحة العمومية. وعلى الرغم من أن اللقاحات تشكل الجزء الأكبر من الاستجابة لهذه التحديات العالمية في مجال الصحة العامة، فمن الواقعي أن نلاحظ أن هذه التدابير المضادة تستجيب فقطبنسبة 1,2. وعلاوة على ذلك، فإن التأخير بين ظهور سلالة معدية جديدة والتطوير الناجح للقاحها أمر لا مفر منه3، مما يؤدي إلى فترة تكون فيها التدابير المتاحة للحد من انتشار الفيروس محدودة للغاية.
ومما يزيد من تأكيد هذه التأخيرات التكاليف التي تلحق بالمجتمع اقتصاديا واجتماعيا. الإنفلونزا الموسمية وحدها مسؤولة عن ما يقرب من 8 مليارات دولار من التكاليف غير المباشرة ، و 3.2 مليار دولار من التكاليف الطبية ، و 36.3 ألف حالة وفاة في الولايات المتحدة الأمريكية سنويا4. هذا قبل النظر في تكاليف البحث اللازمة لتمويل تطوير اللقاحات. وللفاشيات الوبائية آثار أشد حدة على المجتمع، يضاعفها تزايد معدل العولمة كل عام، كما يتضح من الاضطرابات العالمية الناجمة عن ظهور الفيروس التاجي 2 (SARS-CoV-2) (SARS-CoV-2) وانتشاره السريع.
أظهرت الدراسات الحديثة أن المرضى المصابين الذين لديهم عدد أكبر من الخلايا التائية الفطرية المنشطة يميلون إلى الحصول على نتيجة أفضل للمرض 8,9,10. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف مجموعة الخلايا التائية الفطرية إلى مجموعات فرعية متعددة: الخلايا التائية الثابتة المرتبطة بالغشاء المخاطي (MAIT) ، والخلايا التائية Vδ1 γδ ، والخلايا التائية Vδ2 γδ ، والخلايا التائية القاتلة الطبيعية (NKT). تظهر هذه المجموعات الفرعية من الخلايا التائية الفطرية أيضا عدم تجانس داخل سكانها ، مما يزيد من تعقيد التفاعلات بين مجموعات الخلايا المشاركة في الاستجابة المناعية الفطرية11. وبالتالي ، فإن الآلية التي تنشط هذه الخلايا التائية الفطرية ومعرفة المجموعات الفرعية المحددة من الخلايا التائية الفطرية قد توفر وسيلة مختلفة للبحث للحد من الآثار المعدية لهذه الفيروسات على المضيف البشري ، خاصة خلال فترة تطوير اللقاح.
تنتج الخلايا الظهارية المصابة بالإنفلونزا عوامل تنشط الخلايا التائية الفطرية بسرعة12،13،14. وبناء على هذه النتيجة، يهدف نموذج الاستزراع المشترك للواجهة السائلة الهوائية (ALI) الخالي من التلامس إلى محاكاة التفاعلات الكيميائية المبكرة (التي تتوسطها العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها الطبقة الظهارية المصابة) بين الطبقة الظهارية الأنفية المصابة و PBMCs أثناء العدوى المبكرة. إن الفصل المادي بين الطبقة الظهارية الأنفية (المستزرعة على إدخالات الغشاء) و PBMCs (في الغرفة الموجودة تحتها) والسلامة الظهارية يمنع العدوى المباشرة ل PBMCs بواسطة الفيروس ، مما يسمح بإجراء دراسة مفصلة لآثار العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة على PBMCs. وبالتالي يمكن إجراء مزيد من التحقيق في العوامل المحددة لإمكاناتها العلاجية في تحفيز مجموعة الخلايا التائية الفطرية المناسبة التي قد تحمي من عدوى الأنفلونزا. لذلك قامت هذه الورقة بتفصيل طرق إنشاء ثقافة مشتركة لدراسة تنشيط الخلايا التائية الفطرية من العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاستجابات المناعية الفطرية ضد الفيروسات هي مجال دراسة غير مدروس في الإدارة المضادة للفيروسات. تعمل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء والخلايا المناعية الفطرية بشكل متضافر لقمع التكاثر الفيروسي أثناء العدوى ، إلى جانب العمل كمحدد للاستجابة التكيفية المفرطة النشاط إذا لم يتم الاحتفاظ بال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر موظفي الأبحاث في قسم NUS لطب الأنف والأذن والحنجرة وقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة على مساعدتهم في العمل المتعلق بثقافة hNEC والثقافة الفيروسية. كما نود أن نشكر الجراحين والفريق الجراحي في مستشفى الجامعة الوطنية ، قسم طب الأنف والأذن والحنجرة ، على مساعدتهم في توفير عينات الخلايا والدم المطلوبة للدراسة.
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، سنغافورة رقم. NMRC/CIRG/1458/2016 (إلى دي يون وانغ) ووزارة الصحة-OFYIRG19may-0007 (إلى كاي سين تان). كاي سين تان هو حاصل على دعم الزمالة من الزمالة الأوروبية للحساسية والمناعة السريرية (EAACI) 2019.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
