Trasplante de macrófagos cardíacos neonatales de ratón en ratones adultos

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), El Hospital Fuwai, la Academia China de Ciencias Médicas. Se requiere una técnica aséptica durante todo el procedimiento para evitar la contaminación del sitio quirúrgico. 1. Operación de resección apical en ratón Cx3cr1 GFP/+ neonatal de 1 día de edad (fondoC57BL/6) Anestesia Saque a todos los cachorros de ratón de las jaulas y póngalos en una caja limpia y seca. Inserte cada ratón en el hielo durante unos 2-3 minutos. Asegúrese de que haya una barrera delgada como látex o gasa entre el hielo y el cachorro de ratón para evitar la congelación. Identifique suficiente anestesia observando los siguientes signos: piel pálida, falta de movimiento de las extremidades y falta de reflejo del pedaleo. Toracotomía Preenfriar la plataforma de operación de bronce durante la noche a -20 ° C para ayudar a mantener la anestesia. Saque el ratón anestesiado de la caja de hielo y colóelo en una plataforma operativa de bronce. Anclar el ratón en la plataforma operativa en posición supina con cinta adhesiva médica. Coloque la plataforma operativa con el mouse debajo de un estereoscopio. Desinfecte el pecho del ratón con una almohadilla de preparación empapada con betadina y alcohol al 70% o según sea consistente con la política institucional. Incise la piel con un corte de 1 cm en la cuarta área intercostal de la cavidad torácica y luego separe los músculos intercostales usando tijeras microquirúrgicas hasta acceder al corazón. Presione alternativamente el pecho y el abdomen con la ayuda de dos forrceps hasta que el corazón se exteriorice fuera del pecho sin ningún daño mecánico. Coloca las costillas por debajo y por encima de la pequeña incisión como una fijación natural para inmovilizar el corazón. Resección del ápice ventricular Localice el ápice del ventrículo izquierdo. Cortar un diámetro de 1 mm de tejido del ápice ventricular usando tijeras de iridectomía debajo de un estereoscopio. Confirme que la cámara ventricular izquierda está expuesta y comience a supurar. Presione suavemente el corazón hacia atrás a la cavidad torácica con un hisopo de algodón. Sutura los músculos, las costillas y la piel con 8-0 Suturas de proleno. Limpie el mouse a fondo después de la operación. Cuidados post-operación Transfiera el ratón de la plataforma de operación a una manta calefactora de 37 °C para calentar el cuerpo inmediatamente después de la operación. Confirme la anabiosis del ratón observando los siguientes signos: restauración espontánea de la respiración, cambio de color de la piel de pálido a rosa y movimiento de las extremidades. Lleve el ratón operado de vuelta a su madre una vez que se haya recuperado. Mezcle el ratón operado con los materiales de anidación de su madre si es necesario.NOTA: Es importante quitar todos los cachorros de 1 día de edad de la madre a la vez y luego devolverlos todos a la vez después de que todos los cachorros se recuperen. 2. Preparación de la suspensión de macrófagos cardíacos neonatales NOTA: Todos estos procedimientos experimentales deben llevarse a cabo en un lugar oscuro y en condiciones estériles. Cosechar el corazón de un ratón cx3cr1GFP/+ neonatal 1 día después de la resección apical Sacrificar el ratón Cx3cr1GFP/+ un día después de la resección apical. Use un exceso de dióxido de carbono y decapite al ratón secuencialmente para aplicar la eutanasia. Saca el corazón del pecho y sumérgelo en un plato de 10 cm con PBS. Corte los vasos y el tejido conectivo restante lejos de los ventrículos. Cortar el apéndice auricular y el tracto de salida lejos del corazón. Después de que el corazón deje de latir, corte el corazón en1-2 mm 3 piezas en tampón PBS usando tijeras microquirúrgicas(Figura 2A). Disociación cardíaca neonatal del ratón Transfiera el tejido cardíaco cosechado a un tubo que contenga 2,5 ml de mezcla de enzimas precalentadas(Tabla de materiales)y cierre herméticamente el tubo. Invierta el tubo y colóquelo con la tapa hacia abajo (Figura 2B). Ejecutar el programa de disociación cardíaca neonatal(Tabla de Materiales). Separe el tubo del disociador después de que se complete el programa. Agregue 7.5 ml de 1x DMEM con 10% fbS al tubo. Filtre y transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 15 ml(Figura 2C). Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 minutos. Resuspend el pellet celular en 1 ml de solución de lisis de células sanguíneas e incube durante 2 minutos a temperatura ambiente. Agregue 5-10 ml de tampón PBS a la suspensión y centrífuga a 300 x g durante 5 minutos. Resuspend el pellet celular en 1 mL de DMEM con 10% fbs. Aislamiento de macrófagos cardíacos neonatales Clasificación GFP+ macrófagos cardíacos neonatales por FACS. Recibir los macrófagos clasificados en un tubo estéril que contenga 500 μL de DMEM con 10% de FBS. Contar la GFP+ macrófagos (Figura 2D). Resuspend el macrófago en DMEM con 10% fbS a la concentración de 1 x 106 macrófagos por 200 μL de DMEM para su posterior inyección.NOTA: El número de GFP+ macrófagos es pequeño en un neonato (aproximadamente 1 x 105); por lo tanto, se deben usar al menos 10 neonatos para obtener suficientes macrófagos para cada inyección de ratón adulto. 3. Trasplante de macrófagos cardíacos neonatales Realizar una operación de infarto de miocardio en un ratón C57BL/6 macho adulto (6-8 semanas de edad) mediante ligadura de la arteria coronaria anterior izquierda8. Coloque el ratón operado sobre una manta calentada a 37 °C hasta que se recupere. Inyecte por vía intravenosa 200 μL de DMEM con 1 x 106 GFP+ macrófagos cardíacos neonatales en el ratón adulto infarto después de la operación (aproximadamente 6 horas después) a través de la vena de la cola. Envíe el ratón de vuelta a una jaula limpia. 4. Evaluación de resultados Validación de la eficiencia de inyección Anestesiar al ratón operado y cosechar el corazón 7 días después de la operación de infarto de miocardio. Sumerja el corazón en el búfer PBS preenfriado. Fije el tejido cardíaco con poliformaldehído al 4% durante 72 horas a temperatura ambiente con agitación. Deshidratar el tejido cardíaco en dimetilbenceno y etanol. Incruste el tejido cardíaco en parafina y córnelo en secciones con un grosor de 5 μm. Realizar el protocolo estándar de tinción por inmunofluorescencia1. Use α-actinina para marcar los cardiomiocitos. Detectar la GFP+ macrófagos en el corazón que recibe el trasplante. Realizar el protocolo estándar de tinción por inmunofluorescencia1. Utilizar α-actinina y pH3 para marcar cardiomiocitos y proliferación celular, respectivamente (Figura 3A). Evaluación de la reparación cardíaca después del trasplante Utilizar la ecocardiografía en el ratón operado un mes después de la operación1. Analizar la función cardíaca comparando la fracción de eyección del ventrículo izquierdo y el acortamiento fraccional en diferentes grupos (Figura 3B). Anestesiar al ratón operado y cosechar el corazón. Repita los pasos 4.1.2-4.1.5. Realizar un protocolo de tinción de Masson. Analizar el área infartable después de la inyección de macrófagos(Figura 3C).