Трансплантация неонатальных мышиных сердечных макрофагов взрослым мышам

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по использованию и уходу за лабораторными животными. Все протоколы для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC), больницей Фувай, Китайской академией медицинских наук. Асептическая техника требуется на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить загрязнение места операции. 1. Операция апикальной резекции у неонатальной 1-дневной мыши Cx3cr1 GFP/+ (C57BL/6 фон) Анестезия Выведите всех детенышей мышей из клеток и поместите их в чистую сухую коробку. Вставить каждую мышь в лед примерно на 2-3 минуты. Убедитесь, что между льдом и псом мыши есть тонкий барьер, такой как латекс или марля, чтобы предотвратить обморожение. Определите достаточную анестезию, наблюдая за следующими признаками: бледная кожа, отсутствие движения конечностей и отсутствие педального рефлекса. Торакотомии Предварительно охлаждите бронзовую операционную платформу в течение ночи при -20 °C, чтобы помочь сохранить анестезию. Вытащенную анестезированную мышь из ящика для льда и положите ее на бронзовую операционную платформу. Закрепите мышь на операционной платформе в положении лежа на спине с помощью медицинской клейкой ленты. Поместите операционную платформу с мышью на нее под стереоскоп. Продезинфицируйте сундук мышей с помощью подготовительной прокладки, пропитанной бетадином и 70% спиртом, или в соответствии с институциональной политикой. Разрезайте кожу с помощью разреза 1 см в четвертой межречной области грудной полости, а затем отделите межребрачные мышцы с помощью микрохирургических ножниц до тех пор, пока к сердцу не будет доступен. Поочередно надавливать на грудь и живот с помощью двух щипцов до тех пор, пока сердце не выйдет из грудной клетки без каких-либо механических повреждений. Установите ребра ниже и выше небольшого разреза в качестве естественной фиксации для обездвиживания сердца. Резекция верхухи желудочков Найдите вершину левого желудочка. Вырежьте 1 мм диаметром желудочковой верхушкой ткани с помощью ножниц иридэктомии под стереоскопом. Подтвердите, что камера левого желудочка открыта, и начните сочиться. Осторожно прижмите сердце обратно к грудной полости с помощью ватного тампона. Зашивание мышц, ребер и кожи с помощью 8-0 Проленовые швы. Тщательно очистите мышь после операции. Послеоперационный уход Перенесите мышь с рабочей платформы на нагревательное одеяло с 37 °C, чтобы прогреть тело сразу после операции. Подтвердить анабиоз мыши можно, наблюдая за следующими признаками: спонтанное восстановление дыхания, изменение цвета кожи от бледного до розового, движение конечностей. Отведите прооперированную мышь обратно к ее матери, как только она выздоровеет. При необходимости смешайте управляемую мышь с материалами гнездования матери.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить всех 1-дневных щенков у матери сразу, а затем вернуть их все сразу после того, как все щенки будут восстановлены. 2. Приготовление суспензии макрофагов сердца новорожденных ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти экспериментальные процедуры следует проводить в темном месте и в стерильных условиях. Соберите сердце неонатальной мыши Cx3cr1GFP/+ через 1 день после апикальной резекции Усыплите мышь Cx3cr1GFP/+ через день после апикальной резекции. Используйте избыток углекислого газа и обезглавливать мышь последовательно, чтобы применить эвтаназию. Вытастите сердце из груди и погрузите его в 10-сантиметровую посуду с PBS. Отрежьте сосуды и оставшуюся соединительную ткань от желудочков. Отрежьте ушной аппендикс и отток от сердца. После того, как сердце перестанет биться, разрезайте сердце на 1-2 мм3 кусочка в буфере PBS с помощью микрохирургических ножниц(рисунок 2A). Диссоциация сердца новорожденных мышей Переложите собранную сердечную ткань в пробирку, содержащую 2,5 мл предварительно нагретой ферментной смеси(Таблица материалов),и плотно закройте трубку. Перевертите трубку и поместите ее колпачком вниз(рисунок 2B). Запустите программу диссоциации сердцановорожденных (Таблица материалов). Отсоедрите трубку от диссоциатора после завершения программы. Добавьте в пробирку 7,5 мл 1x DMEM с 10% FBS. Фильтруйте и перенесите суспензию в центрифужную трубку 15 мл(рисунок 2C). Центрифугировать клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 минут. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл раствора лизиса клеток крови и инкубируют в течение 2 минут при комнатной температуре. Добавьте 5-10 мл буфера PBS в суспензию и центрифугу при 300 х г в течение 5 минут. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 1 мл DMEM с 10% FBS. Выделение макрофагов сердца новорожденных Сортировать GFP+ неонатальные сердечные макрофаги по FACS. Получают отсортированные макрофаги в стерильной пробирке, содержащей 500 мкл DMEM с 10% FBS. Подсчитайте GFP+ макрофаги(рисунок 2D). Повторно суспендировать макрофаг в ДМЭМ с 10% ФБС в концентрации 1 х 106 макрофагов на 200 мкл ДМЭМ для последующей инъекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество GFP+ макрофагов невелико у одного новорожденного (приблизительно 1 х 105); поэтому для получения достаточного количества макрофагов для каждой инъекции взрослой мыши следует использовать не менее 10 новорожденных. 3. Трансплантация макрофагов сердца новорожденных Провести операцию по инфаркту миокарда взрослой (6-8-недельной) мыши C57BL/6 самца путем перевязки левой передней коронарной артерии8. Положите прооперированную мышь на нагретое при 37 °C одеяло до тех пор, пока она не восстановится. Внутривенно вводят 200 мкл DMEM с 1 х 106 GFP+ неонатальными сердечными макрофагами в инфарктированную взрослую мышь после операции (примерно через 6 часов) через хвостовую вену. Отправьте мышь обратно в чистую клетку. 4. Оценка результатов Проверка эффективности впрыска Обезболивают прооперированную мышь и собирают урожай сердца через 7 дней после операции по инфаркту миокарда. Погрузите сердце в предварительно охлажденный буфер PBS. Зафиксируйте сердечную ткань 4% полиформальдегидом в течение 72 часов при комнатной температуре с встряхиванием. Обезвоживают сердечную ткань в диметилбензоле и этаноле. Встроить сердечную ткань в парафин и разрезать ее на участки толщиной 5 мкм. Выполните стандартный протокол иммунофлуоресцентного окрашивания1. Используйте α-актинин для маркировки кардиомиоцитов. ОбнаружитьGFP+ макрофаги в сердце, получая трансплантацию. Выполните стандартный протокол иммунофлуоресцентного окрашивания1. Используйте α-актинин и рН3 для маркировки кардиомиоцитов и пролиферации клеток соответственно(рисунок 3А). Оценка восстановления сердца после трансплантации Используйте эхокардиографию на оперируемой мыши через месяц после операции1. Анализ сердечной функции путем сравнения фракции выброса левого желудочка и дробного укорочения в разных группах(рисунок 3В). Обезболить прооперированную мышь и собрать урожай сердца. Повторите шаги 4.1.2-4.1.5. Выполните протокол окрашивания Массона. Анализ инфарктной области после инъекции макрофага(рисунок 3С).