השתלת מקרופאגים לב של עכבר יילודים בעכברים בוגרים

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לשימוש וטיפול בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC), בית החולים Fuwai, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה. טכניקה אספטית נדרשת לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום של האתר הכירורגי. 1. פעולת כריתה אפית בעכבר Cx3cr1 GFP/+ בן יום יילודים (רקעC57BL/6) הרדמה תוציא את כל גורי העכברים מהכלובים ותכניס אותם לקופסה יבשה ונקייה. הטמע כל עכבר בקרח במשך כ 2-3 דקות. ודא שיש מחסום דק כגון לטקס או גזה בין הקרח לבין גור העכבר כדי למנוע כוויות קור. זהה הרדמה מספקת על ידי התבוננות בסימנים הבאים: עור חיוור, חוסר תנועת גפיים, וחוסר רפלקס דוושה. בית החזה יש להקדים את פלטפורמת ההפעלה של הברונזה למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס כדי לסייע בשמירה על הרדמה. הוציאו את העכבר המרדים מקופסת הקרח ושמו אותו על משטח הפעלה מברונזה. עגן את העכבר על פלטפורמת ההפעלה בתנוחה על-סופית באמצעות סרט הדבקה רפואי. שים את פלטפורמת ההפעלה עם העכבר עליה מתחת לסטריאוסקופ. לחטא את תיבת העכבר באמצעות כרית הכנה ספוג betadine ו 70% אלכוהול או עולה בקנה אחד עם מדיניות מוסדית. יש להסית את העור עם חתך של 1 ס”מ באזור הבין-צילוגי הרביעי של חלל החזה ולאחר מכן להפריד את השרירים הבין-ציליים באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים עד שהלב נגיש. לחלופין לחץ על החזה והבטן בעזרת שני מלקחיים עד הלב הוא חיצוני מתוך החזה ללא כל נזק מכני. הגדר את הצלעות מתחת ומעל החתירה הקטנה כקיבעון טבעי כדי לשתק את הלב. כריתת פסגת חדרית אתר את פסגת החדר השמאלי. חותכים קוטר של 1 מ”מ של רקמת פסגת חדרית באמצעות מספריים iridectomy מתחת לסטריאוסקופ. אשר כי חדר הלב השמאלי חשוף, ולהתחיל נוטף. לחץ בעדינות על הלב בחזרה לחלל החזה באמצעות צמר גפן. לתפור את השרירים, הצלעות והעור באמצעות 8-0 תפרים פרוליים. נקה את העכבר ביסודיות לאחר הפעולה. טיפול לאחר הניתוח העבר את העכבר מפלטפורמת ההפעלה לשמיכת חימום של 37 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הגוף מיד לאחר הניתוח. אשר אנביוזיס של העכבר על ידי התבוננות בסימנים הבאים: שחזור נשימה ספונטני, שינוי צבע העור חיוור לוורוד, ותנועה של גפיים. קח את העכבר המופעל בחזרה לאמו ברגע שהוא התאושש. יש לתלמוד את העכבר המופעל עם חומרי הקינון של אמו במידת הצורך.הערה: חשוב להסיר את כל הגורים בני יום אחד מהאם בבת אחת ואז להחזיר את כולם בבת אחת לאחר שכל הגורים מתאוששים. 2. הכנת השעיית המקרופאג’ הלבי של הילודים הערה: כל ההליכים הניסיוניים האלה צריכים להתבצע במקום חשוך ובתנאים סטריליים. קציר הלב של עכבר Cx3cr1GFP/+ יילודים יום לאחר כריתה אפית המת חסד את עכבר Cx3cr1GFP/+ יום אחד לאחר כריתת האפסים. השתמש בעודף של פחמן דו חמצני לערוף את ראש העכבר ברצף כדי להחיל המתת חסד. מוציאים את הלב מהחזה וטובלים אותו בצלחת של 10 ס”מ עם PBS. חותכים את כלי הדם ואת רקמת החיבור הנותרת הרחק מהחומים. חותכים את התוספתן האוזרי ואת דרכי היציאה מהלב. לאחר שהלב מפסיק לפעום, חתוך את הלב ל-1-2 מ”מ3 חתיכות במאגר PBS באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיות(איור 2A). ניתוק לב עכבר יילודים העבר את רקמת הלב שנקטפה לצינור המכיל 2.5 מ”ל של תערובת אנזימים שחוממה מראש (שולחן החומרים),וסגור בחוזקה את הצינור. הפוך את הצינור והנח אותו עם המכסה למטה(איור 2B). הפעל את תוכנית ניתוק הלב הילודים(שולחן החומרים). נתק את הצינור מהדיסוציאטור לאחר השלמת התוכנית. הוסף 7.5 מ”ל של DMEM 1x עם 10% FBS לצינור. סנן והעבר את המתלה לצינור צנטריפוגה 15 מ”ל(איור 2C). צנטריפוגה השעיית התא ב 300 x g במשך 5 דקות. resuspend גלולה התא ב 1 מ”ל של תמיסת תאי דם ודגרה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 5-10 מ”ל של חוצץ PBS להשעיה וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות. resuspend גלולה התא ב 1 מ”ל של DMEM עם 10% FBS. בידוד מקרופאג’ לב יילודים מיין מקרופאגים לב ילודים+ יילודים על ידי FACS. קבל את המקרופאגים ממוינים בצינור סטרילי המכיל 500 μL של DMEM עם 10% FBS. ספרו את ה- GFP+ המקרופאגים (איור 2D). resuspend המקרופאג ב- DMEM עם 10% FBS בריכוז של 1 x 106 מקרופאגים לכל 200 μL של DMEM להזרקה מאוחרת יותר.הערה: מספר GFP+ מקרופאגים קטן בניאון אחד (כ- 1 x 105); לכן, לפחות 10 יילודים יש להשתמש כדי להשיג מספיק מקרופאגים עבור כל הזרקת עכבר מבוגר. 3. השתלת מקרופאג’ לב יילודים בצע פעולת אוטם שריר הלב על מבוגר (6-8 שבועות) זכר C57BL /6 עכבר על ידי קשירה של העורק הכלילי השמאלי8. שים את העכבר המופעל על שמיכה מחוממת 37 °C עד שהוא מתאושש. תוך ורידי להזריק 200 μL של DMEM עם 1 x 106 GFP+ מקרופאגים לב יילוד לתוך העכבר הבוגר אוטם לאחר הניתוח (כ 6 שעות מאוחר יותר) דרך וריד הזנב. שלח את העכבר בחזרה לכלוב נקי. 4. הערכת תוצאות אימות יעילות הזרקה להרדים את העכבר המופעל לקצור את הלב 7 ימים לאחר פעולת אוטם שריר הלב. טבול את הלב במאגר PBS מקורר מראש. תקן את רקמת הלב עם 4% פוליפורמלדהיד במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר עם רועד. ייבש את רקמת הלב בדימתיל-בנזנה ואתנול. להטמיע את רקמת הלב בפרפין ולחתוך אותו לחלקים עם עובי של 5 מיקרומטר. בצע את פרוטוקול הכתמת האימונופלואורסצנטיות הסטנדרטי1. השתמש α-אקטיבינין כדי לסמן קרדיומיוציטים. לזהות את GFP+ מקרופאגים בלב מקבל השתלה. בצע את פרוטוקול הכתמת האימונופלואורסצנטיות הסטנדרטי1. השתמש α-אקטיבינין ו- pH3 כדי לסמן קרדיומיוציטים והתפשטות תאים, בהתאמה (איור 3A). הערכת תיקון לב לאחר ההשתלה השתמש אקוקרדיוגרפיה על העכבר המופעל חודש לאחר הפעולה1. נתח את תפקוד הלב על-ידי השוואת שבר הפליטה בחדר השמאלי וקיצור חלקי בקבוצות שונות (איור 3B). להרום את העכבר המופעל ולקצר את הלב. חזור על שלבים 4.1.2-4.1.5. בצע פרוטוקול הכתמת של מאסון. נתח את האזור האוטם לאחר הזרקת מקרופאג'(איור 3C).