Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Ren&#233; D. R&#246;tzer; Verena F. Brox; Konstantin Hennis; Stefan B. Thalhammer; Martin Biel; Christian Wahl-Schott; Stefanie Fenske

doi:10.3791/62101

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicine

Имплантация комбинированных телеметрических трансмиттеров ЭКГ и артериального давления для определения спонтанной барорефлексной чувствительности у мышей в сознании

Published: February 14, 2021

doi:

10.3791/62101

René D. Rötzer¹, Verena F. Brox¹, Konstantin Hennis¹, Stefan B. Thalhammer¹, Martin Biel^1,2, Christian Wahl-Schott³, Stefanie Fenske^1,2

¹Center for Integrated Protein Science (CIPS-M) and Center for Drug Research, Department of Pharmacy,Ludwig-Maximilians-Universität München, ²German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance, ³Hannover Medical School,Institute for Neurophysiology

Summary

Барорефлекс – это механизм регуляции сердечного ритма вегетативной нервной системой в ответ на изменения артериального давления. Мы описываем хирургическую технику имплантации телеметрических передатчиков для непрерывного и одновременного измерения электрокардиограммы и артериального давления у мышей. Это может определить спонтанную чувствительность к барорефлексу, важный прогностический маркер сердечно-сосудистых заболеваний.

Abstract

Артериальное давление (АД) и частота сердечных сокращений (ЧСС) контролируются вегетативной нервной системой (ВНС) и тесно переплетены из-за рефлекторных механизмов. Барорефлекс является ключевым гомеостатическим механизмом противодействия острым, кратковременным изменениям артериального АД и поддержания АД в относительно узком физиологическом диапазоне. АД ощущается барорецепторами, расположенными в дуге аорты и каротидном синусе. При изменении АД сигналы передаются в центральную нервную систему, а затем передаются парасимпатической и симпатической ветвям вегетативной нервной системы для корректировки ЧСС. Повышение АД вызывает рефлекторное снижение ЧСС, падение АД вызывает рефлекторное повышение ЧСС.

Барорефлексная чувствительность (БРС) – это количественная взаимосвязь между изменениями артериального АД и соответствующими изменениями ЧСС. Сердечно-сосудистые заболевания часто связаны с нарушением барорефлексной функции. В различных исследованиях сообщалось о снижении BRS, например, при сердечной недостаточности, инфаркте миокарда или ишемической болезни сердца.

Для определения БРС требуется информация как от АД, так и от ЧСС, которая может быть записана одновременно с помощью телеметрических устройств. Хирургическая процедура описывается, начиная с введения датчика давления в левую сонную артерию и позиционирования его кончика в дуге аорты для контроля артериального давления с последующим подкожным размещением электродов трансмиттера и ЭКГ. Мы также описываем послеоперационную интенсивную терапию и обезболивание. После двухнедельного периода послеоперационного восстановления у мышей, находящихся в сознании и без ограничений, выполняются длительные записи ЭКГ и АД. Наконец, мы включили примеры высококачественных записей и анализ спонтанной чувствительности барорецепторов с использованием метода последовательности.

Introduction

Артериальный барорецепторный рефлекс является основной системой контроля обратной связи у людей, которая обеспечивает краткосрочный и, возможно, более долгосрочный ^1,2-й контроль артериального давления (АД). Этот рефлекс буферизует возмущения в АД, которые возникают в ответ на физиологические или экологические триггеры. Он обеспечивает быстрые рефлекторные изменения частоты сердечных сокращений, ударного объема и общего периферического артериального сопротивления. Рефлекс возникает в чувствительных нервных окончаниях в дуге аорты и каротидных пазухах. Эти нервные окончания составляют артериальные барорецепторы. Сомы нервных окончаний дуги аорты расположены в узловом ганглии, а нервные окончания каротидного синуса расположены в петрозальном ганглии. Рефлекс запускается повышением артериального давления, которое растягивает и активирует нервные окончания барорецепторов (рис. 1А). Активация приводит к залпам потенциала действия, которые передаются централизованно через афферентный аортальный депрессор и нервы сонного синуса к сердечно-сосудистым ядрам ствола мозга, таким как солитарное ядро и дорсальное ядро блуждающего нерва. Изменения активности афферентных нервов, в свою очередь, модулируют вегетативную эфферентную активность. Повышенная активность барорецепторных нервов снижает симпатическую и увеличивает активность парасимпатического нерва. Таким образом, последствиями активации барорецепторов являются снижение частоты сердечных сокращений, сердечного выброса и сосудистого сопротивления, которые вместе противодействуют и буферизуют повышение артериального давления³. Напротив, снижение активности барорецепторных нервов увеличивает симпатическую и уменьшает активность парасимпатического нерва, что увеличивает частоту сердечных сокращений, сердечный выброс и сосудистое сопротивление и, таким образом, противодействует снижению артериального давления.

Многочисленные исследования на людях и животных показали, что барорецепторный рефлекс может быть скорректирован при физиологических условиях, таких как физические упражнения⁴, сон⁵, тепловой стресс⁶ или беременность⁷. Кроме того, есть данные о том, что барорефлекс хронически нарушается при сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как гипертония, сердечная недостаточность, инфаркт миокарда и инсульт. Фактически, барорефлексная дисфункция также используется в качестве прогностического маркера при некоторых сердечно-сосудистых заболеваниях ^8,9,10. Кроме того, дисфункция барорефлекса также присутствует при расстройствах ВНС. Учитывая важность барорецепторного рефлекса для здоровья и болезненных состояний, оценка этого рефлекса in vivo является важным компонентом вегетативных и сердечно-сосудистых исследований с определенными серьезными клиническими последствиями.

Генетические линии мышей являются важными инструментами в сердечно-сосудистых исследованиях. Исследования in vivo таких линий мышей дают ценную информацию о физиологии сердечно-сосудистой системы и патофизиологии и во многих случаях служат доклиническими модельными системами для сердечно-сосудистых заболеваний. Здесь мы приводим протокол телеметрической записи ЭКГ и АД in vivo у сознательных, несдержанных, свободно передвигающихся мышей и описываем, как можно определить чувствительность барорефлекса по этим записям с помощью метода последовательности (рис. 1B). Применяемый метод называется секвенционным методом, т.к. ударно-тактные ряды систолического АД (САД) и интервалов ОР экранируются на наличие коротких последовательностей из трех и более ударов при спонтанном повышении или понижении САД с рефлекторной адаптацией ЧСС. Этот метод является золотым стандартом определения чувствительности барорефлекса, так как исследуются только спонтанные рефлекторные механизмы. Этот метод превосходит старые методы, которые включали инвазивные процедуры, такие как инъекции вазоактивных препаратов, чтобы вызвать изменения АД.

Рисунок 1: Схематическое изображение оценки чувствительности барорефлекса и барорефлекса с использованием метода последовательности . (А) Течение барорефлекса при резком повышении артериального давления. Кратковременное повышение АД ощущается барорецепторами, расположенными в дуге аорты и каротидном синусе. Эта информация передается в центральную нервную систему и вызывает снижение активности симпатического нерва параллельно с увеличением парасимпатической активности. Высвобождение ацетилхолина из нервных окончаний, расположенных в области синоатриального узла, вызывает снижение второго мессенджера цАМФ в клетках кардиостимулятора синоатриального узла и, следовательно, снижение частоты сердечных сокращений. Кратковременное снижение артериального давления имеет противоположный эффект. (B) Схематические трассировки АД во время последовательности вверх (верхняя левая панель) и вниз (верхняя правая панель) из трех последовательных ударов. Последовательность вверх связана с параллельным увеличением интервалов RR (нижняя левая панель), что эквивалентно снижению ЧСС. Последовательность снижения связана с параллельным уменьшением интервалов RR (нижняя правая панель), что эквивалентно увеличению ЧСС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Проводите все исследования на животных в соответствии с местными институциональными руководящими принципами и национальными законами об экспериментах на животных. Для этого эксперимента исследования были одобрены Regierung von Oberbayern и соответствовали немецким законам об экспериментах на животных. Животные WT (фон C57BL / 6J) и животные мышиной модели синдрома больного синуса, демонстрирующие повышенную чувствительность BRS (Hcn4tm3 (Y527F; Р669Э; Для этого исследования были использованы T670A)Biel)11 (смешанный фон C57BL/6N и 129/SvJ). 1. Настройка оборудования Извлеките телеметрический передатчик из стерильной упаковки и укоротите провода ЭКГ до длины, соответствующей размеру мыши. Для 12-недельного самца черной шестилетней мыши (C57BL / 6J) весом ~ 30 г укоротите положительный провод (красный) до длины ~ 45 мм и отрицательный провод (бесцветный) до длины ~ 40 мм с помощью ножниц.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения приведены в качестве ориентации и должны быть адаптированы по мере необходимости (рис. 2). Удалите примерно 6 мм силиконовой трубки отведения ЭКГ с помощью скальпеля, чтобы обнажить провод. Закройте наконечники провода чрезмерной трубкой, оставив непокрытой часть провода ЭКГ ~ 2 мм для записи электрических сигналов. Закрепите силиконовую трубку нерассасывающимся шелковым шовным материалом 5-0 (рис. 2A). Запишите серийный номер передатчика в протокол работы (дополнительный файл 1). Гидратируйте трансмиттер в теплом стерильном 0,9% растворе NaCl. Взвесьте мышь и запишите ее вес. Автоклав все хирургические инструменты перед операцией. Стерилизуйте их во время операции и между операциями с разными животными сухим теплом с помощью стерилизатора горячих стеклянных шариков.ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты должны остыть до комнатной температуры перед использованием, чтобы предотвратить ожоги кожи. Продезинфицируйте рабочий стол, чтобы обеспечить асептические условия. 2. Хирургическая имплантация телеметрических трансмиттеров для комбинированных измерений ЭКГ и артериального давления Расслоение левой общей сонной артерии.Обезболивают мышь внутрибрюшинной инъекцией анестезиологической смеси (100 мг/кг кетамина; 15 мг/кг ксилазина; 1 мг/кг ацепромазина). Перед началом операции проведите тест на защемление пальцев ног, чтобы убедиться, что мышь полностью обезболивается. Используйте триммер, чтобы побрить операционную область ниже подбородка по направлению к поперечным грудным мышцам. Поместите мышь в положение лежа на спине на хирургическую пластину с регулируемой температурой, установленную на 37 °C. Закрепите конечности хирургической лентой и постоянно контролируйте температуру тела с помощью ректального термометра (рис. 2C). Если температура тела падает ниже 37 °C, накройте тело животного стерильной ватной марлей во время операции. Нанесите глазную мазь для защиты глаз животного во время анестезии. Нанесите крем для депиляции на предварительно выбритую операционную область. Удалите волосы и крем для депиляции с помощью ватного диска и теплой воды через 3-4 минуты. Убедитесь, что кожа чистая и на ней нет остатков волос и крема для депиляции, чтобы рана не была загрязнена во время операции. Продезинфицируйте кожу несколькими чередующимися раундами повидон-йодного или хлоргексидинового скраба с последующим добавлением спирта. Поместите животное под препарирующий микроскоп и поместите стерильную драпировку вокруг хирургической области. Сделайте разрез по средней линии 1-1,5 см через кожу шеи, начиная непосредственно под подбородком. Приложите усилия, чтобы сделать разрез как можно более прямым. (Рисунок 2D).ПРИМЕЧАНИЕ: Во время следующих этапов операционная область должна быть влажной путем регулярного применения стерильного, теплого (37 °C) 0,9% NaCl. Создайте подкожное пространство с обеих сторон разреза, отделив кожу от подлежащей соединительной ткани тупыми рассекающими ножницами. Будьте осторожны, чтобы не защемить кожу щипцами слишком сильно, так как это может вызвать некроз и привести к нарушению заживления ран после операции. Разделите околоушные и подчелюстные железы с помощью аппликаторов с ватными наконечниками, чтобы обнажить мускулатуру, покрывающую трахею. Втяните левую слюнную железу с помощью изогнутых щипцов для рассечения, чтобы определить левую сонную артерию, расположенную сбоку от трахеи (рис. 2E). Аккуратно рассекают сонную артерию от прилегающих тканей с помощью изогнутых щипцов. Будьте очень осторожны, чтобы не травмировать блуждающий нерв, который проходит вдоль сосуда. Продолжайте тупое рассечение, чтобы обнажить левую сонную артерию длиной около 10 мм и полностью отделить ее от сосудистой фасции и блуждающего нерва (рис. 2F). Пропустите нерассасывающийся шелковый шов 5-0 под изолированной частью сонной артерии, слегка приподнимая кровеносный сосуд изогнутыми щипцами, чтобы уменьшить трение между швом и сонной артерией, так как это может легко повредить сосудистую стенку. Наложите шов краниально, проксимально к раздвоению сонной артерии, сформируйте узел и завяжите его, чтобы навсегда перевязать сосуд (рис. 2G). Закрепите оба конца шва черепной окклюзии на операционном столе с помощью хирургической ленты. Наложите второй окклюзионный шов под сонную артерию и поместите его каудально на расстоянии ~ 5 мм до черепного шва (рис. 2H). Он нужен для временной окклюзии кровотока во время канюляции артерии. Поэтому завяжите свободный узел и зафиксируйте оба конца шва хирургической лентой. Установите третий шов (надежный шов) между черепным и каудальным швом окклюзии и сделайте свободный узел (рис. 2I). Этот шов необходим для удержания катетера на месте во время канюляции артерии. Приклейте один конец шва к операционному столу. Канюляция левой общей сонной артерии.ПРИМЕЧАНИЕ: Область датчика катетера артериального давления расположена на расстоянии 4 мм от дистального конца и состоит из трубки, содержащей несжимаемую жидкость и биосовместимый гель (рис. 2B). Поскольку эта область очень чувствительна, убедитесь, что на ней нет пузырьков воздуха, и не прикасайтесь к ней ни в коем случае во время процедуры.Согните кончик иглы 24 G под углом ~ 100 °, чтобы использовать ее в качестве проводника катетера. Аккуратно потяните за каудальный шов и зафиксируйте его натяжением, чтобы временно остановить кровоток и слегка приподнять артерию. Осторожно проникните в артерию проксимальнее черепной окклюзии с помощью согнутой иглы (рис. 2J). Захватите катетер щипцами для канюляции сосудов, введите его в небольшой прокол и дайте ему медленно скользить в сосуд. Аккуратно оттяните одновременно согнутую иглу (рис. 2K). Когда катетер достигнет каудального шва окклюзии, слегка затяните надежный шов, чтобы удержать катетер на месте (рис. 2L). Ослабьте каудальный шов окклюзии, чтобы катетер можно было перемещать до тех пор, пока его кончик не будет расположен в дуге аорты.ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно определите правильную длину введения катетера, так как это зависит от размера мыши. Для мышей-самцов с фоном C57BL/6J в возрасте 12 недель и массой тела ~30 г мы рекомендуем вводить катетер до тех пор, пока интегрированная выемка не достигнет шва окклюзии черепа. Правильная глубина введения и размещение катетера для конкретной линии мыши могут быть проверены после эвтаназии животного. После правильного расположения закрепите катетер всеми тремя швами и обрежьте концы как можно короче. Не затягивайте узлы слишком туго, так как это может повредить хрупкий катетер для измерения артериального давления. Рисунок 2: Имплантация комбинированной ЭКГ и трансмиттера артериального давления – канюляция левой сонной артерии . (A) Телеметрический трансмиттер состоит из напорного катетера, двух биопотенциальных электродов и корпуса устройства. (B) Схематическое изображение напорного катетера. Область датчика состоит из несжимаемой жидкости и биосовместимого геля. Катетер должен быть введен в сонную артерию до тех пор, пока выемка не окажется на уровне шва черепной окклюзии, чтобы обеспечить правильное положение в кровеносном сосуде. (C) Анестезированная мышь C57BL/6J, подготовленная к имплантации хирургического трансмиттера. (Д-Л) Последовательность изображений, показывающая хирургическую процедуру канюляции левой сонной артерии. (D) Разрез кожи шейки матки. (E) Открытая трахея для идентификации левой сонной артерии, расположенной сбоку от трахеи. (F) Тупое рассечение для изоляции артерии от прилегающей ткани и блуждающего нерва. (G) Постоянная перевязка левой сонной артерии с наложением шва на окклюзию черепа. (H) Натяжение, наложенное на шов каудальной окклюзии, чтобы временно остановить кровоток. (I) Закрепите шов, чтобы катетер оставался на месте во время канюляции. (J) Канюля с изогнутым наконечником для введения катетера в кровеносный сосуд. (K) Напорный катетер вводится в сонную артерию. (L) Наконечник катетера помещается в дугу аорты, а катетер закрепляется средним швом. Масштабная линейка в D – L показывает 4 мм. Перепечатано с16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Размещение корпуса телеметрического устройства в подкожном кармане на левом боку мыши (рисунок 3).Сформируйте подкожный туннель от шеи, направленный к левому боку животного, и сформируйте небольшой мешочек с помощью маленьких тупых рассекающих ножниц (рис. 3B). Оросите туннель шприцем объемом 1 мл, наполненным теплым стерильным 0,9% раствором NaCl, и введите ~ 300 мкл раствора в мешочек (рис. 3C). Осторожно приподнимите кожу тупыми щипцами и вставьте корпус передающего устройства в мешочек (рис. 3D). На этом этапе будьте очень осторожны, чтобы не вытащить катетер артериального давления из сонной артерии. Размещение отведений ЭКГ в конфигурации Einthoven II.Сформируйте тонкий туннель к правой грудной мышце тупыми рассекающими ножницами и поместите отрицательный (бесцветный) провод в туннель с помощью тупых щипцов. Зафиксируйте концевой конец провода швом на грудной мышце, используя рассасывающийся шовный материал 6-0 (рис. 3E). Сформируйте петлю в положительном (красном) отведении, расположите ее кончик в левой каудальной области ребра и закрепите ее положение швом, используя рассасывающийся шовный материал 6-0.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы оба провода лежали ровно на всем протяжении тела, чтобы избежать раздражения тканей (рис. 3F). Закройте кожу одиночными узлами, используя нерассасывающийся шовный материал 5-0 (рис. 3H). Кроме того, нанесите небольшое количество тканевого клея на каждый узел, чтобы животное не перекусило шов и предотвратило расхождение. Нанесите гидрогель повидон-йода 10% на рану, чтобы предотвратить раневую инфекцию на этапе восстановления. Для упреждающего обезболивания вводят 5 мг/кг карпрофена в 0,9% NaCl подкожно, пока мышь все еще находится под наркозом. Установите нагревательную платформу на 39 ± 1 °C и поместите мышь в отдельную клетку. Поместите одну половину клетки на платформу в течение 12 часов после операции и перенесите мышь в теплое место. Когда животное просыпается от анестезии, у него есть возможность остаться в теплой зоне или переместиться в более прохладную часть клетки. Рисунок 3: Имплантация комбинированной ЭКГ и трансмиттера артериального давления – подкожное размещение электродов ЭКГ и корпуса устройства . (A) Мышь после введения катетера артериального давления. Положение катетера фиксируется окклюзионными швами. (B) Формирование подкожного кармана на левом боку животного тупыми ножницами. (C) Мешочек орошают ~ 300 мкл теплого стерильного физиологического раствора. (D) Корпус устройства помещается в подкожный карман. (E) Концевой конец отрицательного электрода (бесцветный) прикрепляется к правой грудной мышце рассасывающимся шовным материалом. (F) Фиксация положительного электрода (красного) к левым межреберным мышцам. (G) Наложение постоянного шва на грудную мышцу для фиксации положения электродов ЭКГ. (H) Мышь после закрытия кожи. Подкожные положения наконечников электродов ЭКГ обозначены красными кружками. В демонстрационных целях для получения этих снимков использовалось мертвое животное. Пожалуйста, соблюдайте стерильные правила при использовании живого животного. Перепечатано с16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Послеоперационный уходДля послеоперационного обезболивания вводят 5 мг/кг карпрофена в 0,9% NaCl подкожно каждые 12 ч в течение 3-5 дней до заживления раны. Вводят 10 мкл / г теплого раствора рингера-лактата внутрибрюшинно, чтобы защитить животное от обезвоживания. Дайте мыши восстановиться в течение 2-3 недель, прежде чем запускать первые телеметрические измерения. Внимательно следите за общим состоянием здоровья, заживлением ран, массой тела, потреблением пищи и воды в период восстановления. В конце эксперимента усыпьте мышь путем вдыхания углекислого газа (CO2).ПРИМЕЧАНИЕ: Вывих шейки матки или обезглавливание не рекомендуется в качестве метода эвтаназии, так как это может повредить части устройства передатчика ЭКГ и АД. Сбор данных.Примите меры, чтобы избежать акустических и электронных шумов во время записи данных. Кроме того, ограничьте доступ персонала во время записи данных и завершите все процедуры содержания перед экспериментом. Поместите клетку животного на пластину приемника телеметрии и включите телеметрический передатчик, поднеся магнит к животному. Получайте непрерывные записи ЭКГ, артериального давления и активности в течение 72 часов (12-часовой цикл темноты/света) с помощью программного обеспечения для сбора данных (рис. 4). Анализ циркадного ритма частоты сердечных сокращений, артериального давления и активности.Проверьте наличие регулярного циркадного ритма ЧСС, АД и активности с помощью программного обеспечения для сбора данных12 (рис. 5). Анализ данных, включая определение чувствительности барорецепторов методом секвенирования с программным обеспечением для анализа ЭКГ и АД.Экспорт данных об АД и ЧСС из программного обеспечения для сбора данных в программное обеспечение для анализа ЭКГ и АД (дополнительный файл 2). Используйте следующую последовательность команд: Откройте программное обеспечение для анализа ЭКГ и АД > Файл > Необработанные данные из конвертера > Преобразование необработанных данных, отличных от IOX. В новом окне нажмите кнопку Файл > Загрузить данные Dataquest ART4. Снова откроется новое окно, выберите файл данных для экспорта > откроется новое окно, выберите животное из списка «темы», выберите ЭКГ и АД из «списка осциллограмм» и нажмите «ОК». Выберите животных, данные которых должны быть преобразованы, щелкнув Преобразовать данные > Создать файл двоичного сайта IOX. Откройте файл двоичного сайта IOX в программном обеспечении для анализа ЭКГ и АД с помощью следующей последовательности команд: Файл > Загрузить данные IOX > Выберите трассировку АД и ЭКГ > нажмите зеленую галочку.ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие параметры обработки данных оптимизированы для данных, полученных от мышей дикого типа, и в принципе должны соответствовать всем моделям мышей, используемым в доклинических условиях. Однако адаптация этих параметров может потребоваться при работе с конкретными экспериментальными моделями, например, мышами с чрезвычайно высокими или низкими значениями ЧСС и/или АД или различными видами грызунов. В любом случае параметры обработки данных должны быть тщательно проанализированы, чтобы убедиться, что они соответствуют конкретной исследуемой модели. Настройки для анализа ЭКГ, АД и БРС см. в Дополнительном файле 3,4. Для анализа BRS у мышей отрегулируйте параметры BRS, чтобы обнаруживать только последовательности из трех (или более) ударов, демонстрирующих задержку между SBP и RR в один удар, и установите порог изменения SBP и RR на 0,5 мм рт.ст. и 2 мс. Убедитесь, что коэффициент корреляции наклона линии регрессии с графиков RR/SBP больше 0,75, и проанализируйте только участки, демонстрирующие стабильный синусовый ритм. Задайте параметры для анализа ЭКГ, АД и БРС соответственно с помощью следующей последовательности команд: Настройка параметров анализа > > откроется новое окноНастройки ЭКГ (щелкните правой кнопкой мыши в окне «Режим ЭКГ и фильтрация сигналов» (Дополнительный файл 3)). Установите параметры, как описано здесь. Режим: ЭКГ, только RR, режим фильтра: автоматический, в соответствии с установленным ЧСС, ожидаемая частота сердечных сокращений: уд/мин > 300, Базовая ширина фильтра удаления (мс): 100,00, Ширина фильтра удаления шума: 1,00 мс, Режекторный фильтр: 50,0 Гц, Фильтр удаления спайков: выкл., Режим обнаружения выпадения: выкл., Максимальная длина RR (мс): 900.00, RR от скорректированных пиков R: выкл., RR_only режим настроек: Xsmall: мышь, ширина пика R (мс): 10,00, ширина PR (мс): 20,00, ширина RT (мс): 50,00, максимальный артефакт между ударами (%): 50,00, отношение R к другой амплитуде: 3,00, знак пика R: положительный, и дополнительный параметр вычисления: выключен Для настройки артериального давления (АД, настройки давления) щелкните правой кнопкой мыши в окне «Анализатор АД» (Дополнительный файл 4). Установите параметры, как описано здесь. Ширина фильтра шумоудаления (мс): 10.00, Производная ширина фильтра (мс): 6.00, Режекторный фильтр: 50.0 Гц, Фильтр удаления спайков: выключен, Порог проверки (кал. единица): 12.00, Порог отбраковки (кал. единица): 8.00, Производная при начале восходящего хода (кал Ед/с): 10.00, Пределы отклонения: выкл., Задержка от эталонной ЭКГ: определяемое пользователем окно, Минимальная задержка от ЭКГ Rpeak (мс): 10.00, Максимальная задержка от ЭКГ Rpeak (мс): 250.00, Conduct_time_1 от отметки: не вычисляется, Conduct_time_2 от отметки: не вычисляется, BR (частота дыхания): выключено, BRS (чувствительность барорефлекса): включено, Минимальное число последовательных ударов: 3, Число ударов задержки: 1, Значение давления: SBP, Отметка для вычисления интервала импульсов: R, Минимальное изменение давления (caIU): 0,50, Минимальное изменение интервала (мс): 2,00, Минимальная корреляция: 0,75 Экранируйте сигнал активности на наличие 3-часовой последовательности с низкой активностью. В это временное окно проводите анализ BRS, так как высокая активность животных влияет на корреляцию АД и ОР. Выполните анализ АД и ОР в течение этого 3-часового временного окна, разделив 3-часовой анализ на 10-минутные шаги. Выполните анализ BRS с помощью следующей последовательности команд: Открыть окно анализа BRS > Просмотреть > анализ BRS. Откроется панель анализа BRS. Вручную проверяйте каждую последовательность, отображаемую на панели анализа BRS, и исключайте эктопические удары, синусовые паузы, аритмические события или зашумленные данные. Убедитесь, что вы аннулировали каждый удар таких последовательностей, чтобы успешно исключить их из анализа. Экспортируйте результаты анализа BRS в файл электронной таблицы (Results File). Измените параметры, экспортируемые в файл электронной таблицы, с помощью следующей последовательности команд (дополнительные файлы 5-7):Настройте параметры > в разделе list/to file > > txt (Supplemental File 5). Выберите раздел « удары » и любой другой раздел, содержащий интересующую информацию, кроме раздела недействительных ударов. Настройте параметры > в файле list/to > шаги > txt (дополнительный файл 6). Выберите значения шагов для экспорта. Настройте параметры > в файле list/to > beats -> txt (дополнительный файл 7). Убедитесь, что раздел beats файла содержит по крайней мере следующие данные для каждого отдельного удара. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=последовательные интервалы тактов последовательности), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR последующих ударов) Затем нажмите « Файл» > «Сохранить файл результатов». Отсортируйте экспортированные данные по последовательностям вверх и вниз с помощью функции фильтра Excel (дополнительный файл 8). Рассчитайте количество последовательностей, средний наклон BRS, стандартное отклонение и стандартную ошибку наклона BRS для последовательностей вверх и вниз отдельно. Также рассчитайте общее количество последовательностей на 1000 ударов.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон электронной таблицы (TemplateBRS) для автоматической сортировки и анализа последовательностей вверх и вниз приведен в Дополнении (Дополнительный файл 8) и облегчает анализ. Настроив функцию фильтра, вы можете сортировать последовательности по разным номерам ударов (например, трех- или четырехтактные последовательности). Для получения дополнительной информации см. Дополнительные файлы 9-13.Откройте файл результатов и файл TemplateBRS Excel (дополнительный файл 8). Скопируйте данные следующих столбцов из файла результатов: (Давление)_BRS_deltaP, (Давление)_BRS_# и (Давление)_BRS_slope (Дополнительный файл 9). Вставьте данные в соответствующие столбцы электронных таблиц «Последовательности вверх» и «Последовательности вниз» в файле TemplateBRS (дополнительный файл 10). Кроме того, скопируйте данные столбца (Давление)_BRS_SBP из файла результатов (дополнительный файл 11) и вставьте их в электронную таблицу «Все последовательности» в файле TemplateBRS (дополнительный файл 12).ПРИМЕЧАНИЕ: Число в столбце (Pressure)_BRS_# указывается только в последнем такте последовательности и отображает длину последовательности. Последовательности вверх и вниз можно различить по знаку (Давление)_deltaP значение. Отрицательные значения второго и третьего такта последовательности из трех ударов указывают на последовательность падения. Положительные значения указывают на последовательность вверх, соответственно. Отфильтруйте скопированные данные с параметрами фильтра по умолчанию. Нажмите на значок фильтра в столбце (Давление)_BRS_# и нажмите «ОК» (Дополнительный файл 13). Примените этот шаг к электронным таблицам «Последовательности вверх» и «Последовательности вниз».ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтры электронных таблиц для трехтактных последовательностей. Если запрашиваются другие длины последовательности, настройка этого столбца должна быть изменена в выпадающем меню. Расчеты количества последовательностей, среднего наклона BRS, стандартного отклонения и стандартной ошибки наклона BRS отображаются в зеленых полях электронных таблиц «Последовательности вверх» и «Последовательности вниз». Расчеты общего количества последовательностей на 1000 ударов отображаются в зеленом поле электронной таблицы «Все последовательности».

Representative Results

Положительные результаты исходных данных ЭКГ и АДС помощью этого протокола можно получить высококачественные данные ЭКГ и АД (рис. 4 и дополнительный файл 14), что позволяет не только проводить точный анализ БРС, но и анализировать широкий спектр параметров, полученных из ЭКГ или АД, например, интервалы ЭКГ (рис. 4B, верхняя панель), параметры артериального давления (рис. 4B, нижняя панель), частоту сердечных сокращений и вариабельность артериального давления, выявление аритмии и т.д.12,13,14,15. Рисунок 4: Телеметрические записи ЭКГ и АД. (A) Репрезентативная высококачественная трассировка ЭКГ (верхняя панель) и соответствующие высококачественные необработанные записи АД (нижняя панель). (B) Увеличение следов ЭКГ (верхняя панель). Указываются зубец P, комплекс QRS, зубец T и интервал RR. Увеличение соответствующих данных BP (нижняя панель). Показано диастолическое АД (ДАД) и систолическое АД (САД). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Положительные результаты для циркадного ритмаЗдоровая мышь, которая достаточно восстановилась после операции, показывает физиологическое повышение активности, ЧСС и АД во время активной (темной) фазы (рис. 5). Многие различные факторы могут нарушить этот регулярный циркадный ритм. К ним относятся психологический стресс, акустический или электрический шум и боль. Например, острое болевое состояние сразу после операции приведет к увеличению частоты сердечных сокращений с одновременным снижением активности. Таким образом, циркадный ритм является важным показателем здоровья и благополучия животных и должен регулярно проверяться перед анализом BRS. Рисунок 5: Анализ долгосрочных телеметрических измерений для определения вариаций циркадного ритма. Циркадный ритм частоты сердечных сокращений (A), активности (B), систолического артериального давления (C) и диастолического артериального давления (D) усреднен у 9 самцов мышей дикого типа C57BL / 6J в течение 12-часовых светлых и темных циклов. Серые области изображают фазу активности (темную), а белые области изображают фазу покоя (светлых) животных. Все параметры физиологически повышены во время активной (темной) фазы животного. Данные представлены в виде среднего значения +/- SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Положительные результаты анализа BRSПосле выполнения анализа, как описано в разделе протокола 2.8, программное обеспечение обнаружит последовательности вверх и вниз соответственно. Используемый метод называется методом последовательности, поскольку изменения интервалов САД и ОР исследуются от удара к удару во время коротких последовательностей из трех или более ударов со спонтанным повышением или понижением САД (рис. 6). Непрерывное повышение САД в течение трех ударов сердца вызывает рефлекторное увеличение парасимпатической активности и, как следствие, замедляет ЧСС, что эквивалентно более длительным интервалам ОР. Задержка для рефлекторной адаптации ЧСС составляет один удар. Такая последовательность показана на рисунке 6А и определяется как последовательность вверх. Напротив, непрерывное снижение САД в течение трех ударов с параллельным повышением ЧСС (уменьшение интервала ОР) определяется как последовательность снижения (рис. 6B). Чтобы оценить корреляцию между RR и SBP, оба параметра строятся относительно друг друга и вычисляется наклон (мс/мм рт.ст.) линии линейной регрессии для каждой последовательности (рис. 6A, B, нижние панели). После сортировки по последовательностям вверх и вниз среднее количество последовательностей на 1000 ударов (рис. 6C) и среднее усиление спонтанных BRS могут быть рассчитаны для последовательностей вверх и вниз соответственно (рис. 6D, E). Коэффициент усиления спонтанных БРС отражается наклоном линии линейной регрессии, вычисляемой из соотношения РР/СБП. Отклонение от нормальных значений BRS может иметь различные причины. К ним относятся изменения во входе ВНС или изменения в чувствительности синоатриального узла к входу вегетативной нервной системы. На рисунке 6 показано увеличение BRS на мышиной модели синдрома больного синусового узла (SSS) с преувеличенной реакцией синоатриального узла на вагусный ввод11. Рисунок 6: Оценка БРС с использованием метода последовательности. (A) Репрезентативный след АД мыши C57BL/6J дикого типа во время последовательности из трех последовательных ударов (верхняя панель), связанных с параллельным увеличением интервала RR (средняя панель), что эквивалентно снижению ЧСС. Интервалы RR были построены на графике по SBP (нижняя панель). Наклон линии регрессии (красная линия) для восходящей последовательности, изображенной на верхней и средней панели (WT, черные круги), составил 4,10 мс/мм рт.ст. Репрезентативная взаимосвязь RR/SBP мышиной модели синдрома больного синуса дала увеличенный наклон 6,49 мс / мм рт.ст., что указывает на повышенный BRS (SSS, серые круги). (B) Репрезентативная последовательность вниз мыши дикого типа с падением SBP (верхняя панель) и последующим уменьшением интервала RR (средняя панель), что приводит к наклону BRS 4,51 мс/мм рт.ст. (нижняя панель; WT, черные круги). Репрезентативная взаимосвязь RR/SBP мышиной модели синдрома больного синуса (SSS, серые круги) с наклоном 7,10 мс/мм рт.ст. Ориентация красных стрелок указывает направление последовательностей (последовательность вверх или вниз). (C) Общее количество последовательностей на 1000 ударов для мышей WT и SSS. (D) Средний наклон соотношения RR/SBP для восходящих последовательностей для мышей WT и SSS. (E) Средний наклон соотношения RR/SBP для нисходящих последовательностей для мышей WT и SSS. Статистические данные в (C-E) были выполнены на основе результатов шести самцов животных WT и восьми самцов мышиной модели синдрома больного синуса. Прямоугольные диаграммы показывают срединную линию, perc 25/75 и минимальное/максимальное значение; Открытые символы представляют среднее значение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Отрицательный результат для качества исходных данныхОсобенно во время фаз с более высокой активностью качество сигнала может снизиться (рис. 7 и дополнительные файлы 15,16). Это может быть вызвано временным смещением или неправильным положением катетера АД или отведений ЭКГ, или и того, и другого из-за движения животного. Кроме того, активность скелетных мышц может быть обнаружена по отведениям ЭКГ и вызывать шум (рис. 7B, верхняя панель). При описанных выше настройках программного обеспечения эти низкокачественные удары не обнаруживаются и, следовательно, исключаются из анализа. Тем не менее, ручная проверка анализируемых исходных данных является обязательной. Рисунок 7: Примеры некачественных необработанных сигналов . (A) Сигнал ЭКГ (верхняя панель) обнаруживается с хорошим качеством, но качество сигнала BP (нижняя панель) низкое. (B) Качество сигнала ЭКГ (верхняя панель) и АД (нижняя панель) недостаточны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Отрицательные результаты анализа BRSНастройки анализа BRS, перечисленные в разделе протокола 2.8.3, в целом необходимы для быстрого и правильного обнаружения последовательностей вверх и вниз. Минимальный коэффициент корреляции для линии регрессии установлен равным 0,75. Установка слишком низких значений минимального коэффициента корреляции приводит к ложным обнаружениям последовательностей, которые не отражают барорефлексную активность, а скорее являются результатом аритмических ударов (рис. 8). Для анализа BRS необходимо анализировать только эпизоды со стабильным синусовым ритмом. Эктопические удары или другие аритмические явления, например, синусовые паузы, могут быть обнаружены с помощью опции ВСР программного обеспечения для анализа ЭКГ и АД и должны быть признаны недействительными. Рисунок 8: Последовательности, которые не отражают барорефлексную активность . (A) След ЭКГ мыши с легкой синусовой аритмией. (B) Запись АД, показывающая спонтанное повышение САД. (C) Соответствующие интервалы ОР указывают на снижение ЧСС при повышении АД. (D) График САД и соответствующие интервалы ОР. Низкий коэффициент корреляции линии регрессии свидетельствует о том, что снижение ЧСС было вызвано не активностью барорефлекса, а синусовой аритмией. (E) Необработанный след ЭКГ, изображающий синусовую паузу. (F) Соответствующий необработанный сигнал BP. Синусовая пауза вызывает падение диастолического артериального давления. Систолическое артериальное давление при последующем ударе практически не влияет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный файл 1: Протокол операции. Шаблон для документирования хирургической процедуры и послеоперационного ухода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2: Преобразование данных Dataquest A.R.T в данные IOX для анализа в программном обеспечении ecgAUTO. Выберите животных в списке предметов (слева) и давление и ЭКГ в списке осциллограмм (справа). Нажмите OK для преобразования данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 3: Настройки ЭКГ для анализа BRS. Задайте параметры, как указано в списке, нажмите OK и примените конфигурацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 4: Настройки BP для анализа BRS. Задайте параметры, как указано в списке, нажмите OK и примените конфигурацию. Сохраните конфигурацию в виде файла конфигурации, чтобы иметь возможность легко загружать настройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 5: Параметры в окне списка/файла для “разделов”. Выберите разделы для экспорта под заголовком разделов > txt (выбрано) и нажмите Применить!. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 6: Параметры в окне списка/файла для «шагов». Выберите данные шага для экспорта под заголовком steps > txt (выбрано) и нажмите «Применить!». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 7: Параметры в окне списка/файла для “beats”. Выберите значения для экспорта под заголовком beats > txt (выбрано) и нажмите «Применить!». Для анализа БРС необходимы отмеченные галочкой параметры. Обратите внимание на порядок выбора, обозначенный цифрами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 8: Файл электронной таблицы TemplateBRS. Шаблон электронной таблицы для автоматической сортировки и анализа последовательностей вверх и вниз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 9: Копирование соответствующих данных из файла результатов I. Скопируйте столбцы (Давление)_BRS_deltaP, (Давление)_BRS_# и (Давление)_BRS_slope из файла результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 10: Файл шаблона электронной таблицы (TemplateBRS) для сортировки и анализа данных I. Вставьте скопированные данные в соответствующие столбцы электронной таблицы «Последовательности вверх» и «Последовательности вниз» в файле электронной таблицы TemplateBRS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 11: Копирование соответствующих данных из файла результатов II. Скопируйте столбец (Давление)_BRS_SBP из файла результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 12: Файл шаблона электронной таблицы (TemplateBRS) для сортировки и анализа данных II. Вставьте скопированные данные SBP в электронную таблицу «Все последовательности» в файле электронной таблицы TemplateBRS, чтобы рассчитать общее количество последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 13: Фильтрация и анализ последовательностей. В таблице “Последовательности вверх” файла электронной таблицы TemplateBRS откройте выпадающее меню фильтра столбцов (Pressure)_BRS_# и нажмите OK без изменения каких-либо параметров. Это автоматически отсортирует данные и обновит вычисления для последовательностей с 3 ударами. Повторите это для электронной таблицы «Последовательности вниз». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 14: Скриншот высококачественной записи, обнаруженной с помощью программного обеспечения для анализа ЭКГ и АД. Верхний след (ЭКГ) показывает обнаружение каждого R-пика, а нижний след (BP) показывает обнаружение каждого пика диастолического давления (DP) и систолического давления (SP). Области под успешно обнаруженными пиками отмечены красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 15: Скриншот записи АД низкого качества, где параметры АД определяются лишь частично. Верхняя трасса (ЭКГ) показывает обнаружение каждого R-пика, а нижняя трасса (АД) показывает промежутки между обнаруженными пиками АД. Обнаруженные пики диастолического давления (ДП) и систолического давления (СП) отмечены красными областями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 16: Скриншот записи ЭКГ и АД низкого качества, где параметры ЭКГ и АД не могут быть обнаружены. Верхняя трасса (ЭКГ) показывает область (фиолетовый фон), где параметры ЭКГ не могут быть обнаружены. Обнаружение АД (нижняя трассировка) также не удалось из-за низкого качества сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Значимость метода по отношению к альтернативным методам
В настоящей работе мы представляем подробный протокол количественной оценки спонтанных БРС с использованием метода последовательности. В этом подходе используются спонтанные изменения АД и рефлекторные изменения ЧСС, измеряемые с помощью телеметрии ЭКГ и АД. Преимущество этого метода заключается в том, что оба параметра могут быть зарегистрированы у сознательных, свободно движущихся, неограниченно удерживаемых животных, не беспокоя животных, войдя в комнату, где проводятся измерения, или даже путем физического взаимодействия, необходимого для инъекции наркотиков. Этот момент очень важен, поскольку было ясно показано, что такие нарушения серьезно мешают записи ЧСС и АД. Например, инъекция препаратов требует фиксации мышей, что вызывает максимальную стрессовую реакцию, повышающую ЧСС до 650-700 ударов в минуту. Чтобы обойти эти стрессовые реакции, BRS был ранее определен у анестезированных мышей. Однако стандартные анестетики, используемые в ветеринарии, такие как кетамин / ксилазин или изофлуран, вызывают брадикардию и влияют на вегетативные рефлекторные реакции, ограничивая достоверность этих подходов и интерпретацию результатов. Для частичного преодоления этих ограничений были использованы имплантируемые устройства доставки лекарств, т.е. осмотические насосы, которые могут высвобождать лекарства в брюшную полость. Однако с помощью осмотических насосов невозможно применять болюсную определенную дозу препарата, ограничивающую применение таких устройств. В качестве альтернативы можно использовать сложные инфузионные катетеры¹⁷ может быть имплантирован мышам для введения лекарств. Тем не менее, эти катетеры сложны в обращении и требуют хирургических навыков, сравнимых с теми, которые требуются для имплантации телеметрических устройств, в то же время давая меньший научный результат по сравнению с измерениями спонтанной БРС. Помимо технических проблем, связанных с измерением БРС с использованием инъекционных наркотиков, существуют некоторые ограничения, связанные с действием препарата как таковым. Традиционные подходы к определению BRS включают болюсные инъекции вазоактивных препаратов. Однако болюсные инъекции вазоконстрикторов (например, фенилэфрина) или вазодилататоров (например, нитропруссида натрия) считаются чрезмерным и нефизиологическим стимулом для рефлекторной адаптации ЧСС к изменениям АД¹⁸. Спонтанная активность барорецепторного рефлекса также может быть количественно определена с помощью спектральных методов. Один из этих методов оценивает БРС в частотной области путем расчета соотношения между изменениями ЧСС и изменениями артериального давления в определенной полосе частот¹⁸^,¹⁹. Другие спектральные методы включают определение передаточной функции АД и ЧСС или количественную оценку когерентности между АД и ЧСС²⁰^,²¹. Эти методы также требуют телеметрического сбора спонтанных параметров АД и ЧСС, и, хотя они подходят для определения спонтанных БРС, они требуют интенсивных вычислительных инструментов и сложны в применении. Кроме того, все спектральные методы страдают ограничением, заключающимся в том, что нестационарные сигналы исключают применение спектральных методов. В частности, спектральные пики, индуцированные ритмами дыхания, могут быть уменьшены у пациентов-людей, попросив пациента прекратить дыхание, в то время как у мышей это, очевидно, невозможно. Поэтому отношение сигнал/шум у мышей часто бывает довольно низким. Учитывая ограничения рассмотренных выше методов, мы отдаем предпочтение методу последовательности определения BRS у мышей. Существенным преимуществом этого метода является тот факт, что он является неинвазивным методом, который позволяет получить данные о спонтанной БРС в реальных условиях²². Еще одним важным моментом является то, что продолжительность последовательностей, анализируемых с использованием метода последовательностей, довольно короткая, включая 3-5 ударов. Рефлекторная регуляция ЧСС блуждающим нервом происходит очень быстро и хорошо в рамках этих последовательностей. Таким образом, метод последовательности хорошо подходит для оценки вклада блуждающего нерва в BRS. Напротив, регуляция симпатической нервной системой происходит намного медленнее. Фактически, во время этих коротких последовательностей можно предположить, что активность симпатической нервной системы почти постоянна. Таким образом, метод настроен на селективное выявление рефлекторных изменений ЧСС, обусловленных активностью блуждающего нерва.

Интерпретация данных СТС
Для интерпретации дисфункции БРС или данных БРС как таковых важно учитывать индивидуальные функциональные уровни, которые участвуют в барорецепторном рефлексе. На нейронном уровне могут быть затронуты афферентные, центральные или эфферентные компоненты рефлекса²³. На сердечно-сосудистом уровне может присутствовать сниженная или преувеличенная реакция синоатриального узла на ввод ВНС^11,24. Изменения на каждом уровне могут привести к изменениям в БРС. Для того, чтобы проанализировать, ответственны ли нейронные и/или сердечные механизмы за наблюдаемые изменения в BRS, можно использовать подходы к делеции сердечных или нейронных специфических генов, нокдауну или редактированию генов.

Критические шаги в протоколе
Наиболее сложным и важным этапом в этом протоколе является препарирование и канюляция левой сонной артерии (этап 2.3). Натяжение шва каудальной окклюзии должно быть достаточно высоким, чтобы полностью остановить кровоток перед канюляцией. В противном случае даже небольшое подтекание крови во время канюляции может сильно ограничить видимость или даже вызвать у мыши смертельное кровотечение. Канюляция должна быть успешной с первой попытки. Тем не менее, при неудаче первой попытки все же можно осторожно повторить попытку канюляции.

Срединный разрез и подкожный туннель от шеи к левому боку (этап 2.3) должны быть достаточно большими, чтобы легко вводить трансмиттер без силы, но также должны быть как можно меньше, чтобы удерживать передатчик на месте. В противном случае нужно будет зафиксировать его в нужном положении с помощью шовного материала или тканевого клея. Поскольку у мышей очень нежная кожа, некроз кожи может произойти, если туннель для передатчика слишком мал.

Если электроды ЭКГ слишком длинные, чтобы поместиться в подкожный туннель (шаг 2.4), необходимо сформировать новый наконечник, укоротив электрод до нужной длины. Электрод должен лежать ровно на теле по всей длине провода. Слишком длинные электроды будут беспокоить животных, и они будут пытаться открыть рану, чтобы удалить передатчик, что приведет к риску раздражения тканей и расхождения раны. Слишком короткие провода, конечно, не могут быть расширены, и может случиться так, что в этом случае электроды не могут быть расположены таким образом, чтобы они соответствовали конфигурации Einthoven II. Поэтому мы рекомендуем определить оптимальную длину отведений ЭКГ на мертвой мыши того же пола, веса и генетического фона.

Мышам следует дать более длительное время восстановления после имплантации трансмиттера, если у них нет нормального циркадного ритма, и это не является фенотипом исследуемой линии мыши (шаг 2.7). Другой причиной нарушения циркадных ритмов может быть недостаточная акустическая изоляция животного помещения или персонала, входящего в помещение во время измерения.

Анализ данных ЭКГ, АД и БРС прост (шаг 2.8). Наиболее важным шагом является исключение из анализа данных эктопических ударов, синусовых пауз, аритмических эпизодов или участков с некачественными сигналами.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Немецким научно-исследовательским обществом [FE 1929/1-1 и WA 2597/3-1]. Мы благодарим Сандру Диршль за отличную техническую помощь и Джулию Риллинг за ветеринарную консультацию.

Materials

Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL	CP-Pharma, Germany	1229	anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe	Wolfram Droh GmbH, Germany	9166017V
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer AG, Germany
Blunt dissecting scissors	Fine Science Tools GmbH, Germany	14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL	CP-Pharma, Germany	115	preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectant	BODE Chemie GmbH, Germany	9803650
Cotton Tipped Applicator sterile	Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany	09-119-9100
Forceps – Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools GmbH, Germany	11253-25
Forceps – straight	Fine Science Tools GmbH, Germany	11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton	Paul Hartmann AG. Germany	401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters	Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probe	Harvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools GmbH, Germany	18000-45
Ketamine 10%	Ecuphar GmbH, Germany	799-760	anesthesia
Magnet	Data Sciences International, United States		transmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter	Fine Science Tools GmbH, Germany	12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710005525	24 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710004020	27 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)	Resorba Medical, Germany	PA10273	lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)	Resorba Medical, Germany	4023	skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope	Zeiss, Germany
Pilca depilatory mousse	Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany	6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%	Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solution	B. Braun Melsungen AG, Germany	401-951
Sensitive plasters, Leukosilk	BSN medical GmbH, Germany	102100	surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesive	SMI, Belgium	ZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)	Resorba Medical, Germany	G2105	lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1	Procter & Gamble
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools GmbH, Germany	18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%	Ecuphar GmbH, Germany	797469	anesthesia
Data acquisition and analysis	Source
DSI Data Exchange Matrix	Data Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI Ponemah	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for mice	Data Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1	Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11	EMKA Technologies		ECG and BP analysis software
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, United States

References

Landgren, S. On the excitation mechanism of the carotid baroceptors. Acta Physiologica Scandinavica. 26 (1), 1-34 (1952).
Heyman, C., Neil, E. Reflexogenic areas of the cardiovascular system. British Journal of Surgery. 46 (195), 92 (1958).
Lu, Y., et al. The ion channel ASIC2 is required for baroreceptor and autonomic control of the circulation. Neuron. 64 (6), 885-897 (2009).
Fadel, P. J., Raven, P. B. Human investigations into the arterial and cardiopulmonary baroreflexes during exercise. Experimental Physiology. 97 (1), 39-50 (2012).
Nagura, S., Sakagami, T., Kakiichi, A., Yoshimoto, M., Miki, K. Acute shifts in baroreflex control of renal sympathetic nerve activity induced by REM sleep and grooming in rats. The Journal of Physiology. 558, 975-983 (2004).
Crandall, C. G., Cui, J., Wilson, T. E. Effects of heat stress on baroreflex function in humans. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (3), 321-328 (2003).
Crandall, M. E., Heesch, C. M. Baroreflex control of sympathetic outflow in pregnant rats: effects of captopril. The American Journal of Physiology. 258 (6), 1417-1423 (1990).
Mortara, A., et al. Arterial baroreflex modulation of heart rate in chronic heart failure: clinical and hemodynamic correlates and prognostic implications. Circulation. 96 (10), 3450-3458 (1997).
La Rovere, M. T., Bigger, J. T., Marcus, F. I., Mortara, A., Schwartz, P. J. Baroreflex sensitivity and heart-rate variability in prediction of total cardiac mortality after myocardial infarction. ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) Investigators. Lancet. 351 (9101), 478-484 (1998).
Robinson, T. G., Dawson, S. L., Eames, P. J., Panerai, R. B., Potter, J. F. Cardiac baroreceptor sensitivity predicts long-term outcome after acute ischemic stroke. Stroke. 34 (3), 705-712 (2003).
Fenske, S., et al. cAMP-dependent regulation of HCN4 controls the tonic entrainment process in sinoatrial node pacemaker cells. Nature Communications. 11 (1), 5555 (2020).
Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
Thireau, J., Zhang, B. L., Poisson, D., Babuty, D. Heart rate variability in mice: a theoretical and practical guide. Experimental Physiology. 93 (1), 83-94 (2008).
Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory Mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260 (2011).
Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
Optical and electrophysiological approaches to examine the role of cAMP-dependent regulation of the sinoatrial pacemaker channel HCN4. Dissertation, LMU Munich Available from: https://edoc.ub.uni-muenchen.de/24431/1/Brox_Verena.pdf (2019)
Just, A., Faulhaber, J., Ehmke, H. Autonomic cardiovascular control in conscious mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (6), 2214-2221 (2000).
Parati, G., Di Rienzo, M., Mancia, G. How to measure baroreflex sensitivity: from the cardiovascular laboratory to daily life. Journal of Hypertension. 18 (1), 7-19 (2000).
Robbe, H. W., et al. Assessment of baroreceptor reflex sensitivity by means of spectral analysis. Hypertension. 10 (5), 538-543 (1987).
Pinna, G. D., Maestri, R., Raczak, G., La Rovere, M. T. Measuring baroreflex sensitivity from the gain function between arterial pressure and heart period. Clinical Science. 103 (1), 81-88 (2002).
Pinna, G. D., Maestri, R. New criteria for estimating baroreflex sensitivity using the transfer function method. Medical and Biological Engineering and Computing. 40 (1), 79-84 (2002).
Laude, D., Baudrie, V., Elghozi, J. L. Applicability of recent methods used to estimate spontaneous baroreflex sensitivity to resting mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 294 (1), 142-150 (2008).
Ma, X., Abboud, F. M., Chapleau, M. W. Analysis of afferent, central, and efferent components of the baroreceptor reflex in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 283 (5), 1033-1040 (2002).
Fleming, S., et al. Impaired Baroreflex Function in Mice Overexpressing Alpha-Synuclein. Frontiers in Neurology. 4 (103), (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Rötzer, R. D., Brox, V. F., Hennis, K., Thalhammer, S. B., Biel, M., Wahl-Schott, C., Fenske, S. Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (168), e62101, doi:10.3791/62101 (2021).