意識のあるマウスにおける自発的な圧反射感受性を決定するための遠隔ECGと血圧伝達器の組み合わせの埋め込み

すべての動物実験は、地域の施設のガイドラインおよび動物実験に関する国内法に準拠して実施してください。この実験のために、研究はRegierung von Oberbayernによって承認され、動物実験に関するドイツの法律に準拠していました。WT動物(C57BL/6Jバックグラウンド)およびBRS感受性の増加を示す洞不全マウスモデルの動物(Hcn4tm3(Y527F;R669E;T670A)Biel)11 (C57BL/6Nと129/SvJバックグラウンドの混合)を本研究に用いた。 1.機器のセットアップ 遠隔測定トランスミッターを滅菌パッケージから取り出し、ECGリードをマウスのサイズに適した長さに短くします。体重が~30 gの12週齢のオスのブラックシックスマウス(C57BL/6J)の場合、ハサミを使用して正の鉛(赤)を~45 mmの長さに、負の鉛(無色)を~40 mmの長さに短くします。注意: これらの値は方向として与えられ、必要に応じて調整する必要があります(図2)。 メスを使用してECGリードのシリコンチューブの約6mmを取り外し、ワイヤーを露出させます。電気信号を記録するために、ECGワイヤの~2mmの部分を覆い隠さないように、ワイヤの先端を過剰なチューブで覆います。非吸収性の5-0シルク縫合材料でシリコンチューブを固定します(図2A)。 送信機のシリアル番号を操作プロトコル(補足ファイル1)に書き留めます。 温かい滅菌済み0.9%NaCl溶液でトランスミッタを水和します。 マウスの重量を量り、その重量を記録します。 手術前にすべての手術器具をオートクレーブします。手術中および異なる動物の操作の間に、熱いガラスビーズ滅菌器を使用して乾熱でそれらを滅菌します。注意: 手術器具は、皮膚の火傷を防ぐために、使用前に室温まで冷却する必要があります。 無菌状態を確保するために作業台を消毒します。 2.ECGと血圧を組み合わせた測定のためのテレメトリトランスミッタの外科的埋め込み 左総頸動脈の解剖。麻酔ミックス(100 mg / kgケタミン、15 mg / kgキシラジン、1 mg / kgアセプロマジン)の腹腔内注射によってマウスを麻酔します。.つま先のピンチテストを実行して、手術を開始する前にマウスが完全に麻酔されていることを確認します。 トリマーを使用して、あごの下から横胸筋に向かって手術領域を剃ります。 37°Cに設定された温度制御された手術プレート上でマウスを仰臥位に置きます。 手足をサージカルテープで固定し、直腸体温計で体温を継続的に監視します(図2C)。体温が37°Cを下回った場合は、手術中に動物の体を滅菌綿ガーゼで覆います。 麻酔中に動物の目を保護するために目の軟膏を塗ります。 以前に剃った手術部位に脱毛クリームを塗ります。3〜4分後に綿パッドと温水を使用して髪と脱毛クリームを取り除きます。手術中に傷口が汚染されないように、皮膚が清潔で髪の毛や脱毛クリームが残っていないことを確認してください。 ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブとそれに続くアルコールの交互のラウンドで皮膚を消毒します。 動物を解剖顕微鏡の下に置き、手術領域の周りに滅菌ドレープを置きます。 あごのすぐ下から始めて、首の皮膚から1〜1.5 cmの正中線を切開します。切開をできるだけまっすぐにするように努力してください。(図2D)。注:次の手順では、滅菌済みの温かい(37°C)0.9%NaClを定期的に塗布して、手術領域を湿らせておく必要があります。 鈍い解剖ハサミで皮膚を下にある結合組織から分離することにより、切開の両側に皮下スペースを作成します。鉗子で皮膚を強くつまみすぎないように注意してください、これは壊死を引き起こし、手術後の創傷治癒障害につながる可能性があるためです。 綿の先端アプリケーターを使用して耳下腺と顎下腺を分離し、気管の上にある筋肉組織を露出させます。 湾曲した解剖鉗子で左唾液腺を引っ込めて、気管の横方向に位置する左頸動脈を特定します(図2E)。 湾曲した鉗子を使用して、隣接する組織から頸動脈を慎重に解剖します。血管に沿って走っている迷走神経を傷つけないように十分に注意してください。鈍的解離を続け、左頸動脈を約10mmの長さに露出させ、血管筋膜および迷走神経から完全に分離します(図2F)。 血管壁を簡単に損傷する可能性があるため、縫合糸と頸動脈の間の摩擦を減らすために湾曲した鉗子で血管をわずかに持ち上げながら、頸動脈の孤立した部分の下に非吸収性の5-0シルク縫合糸を通過させます。 縫合糸を頭蓋骨に、頸動脈の分岐部のすぐ近くに置き、結び目を形成し、それを結び、血管を永久に結紮します(図2G)。頭蓋閉塞縫合の両端をサージカルテープで手術台に固定します。 頸動脈の下に2番目の咬合縫合糸を通過させ、頭蓋縫合糸から~5 mmの距離で尾側に置きます(図2H)。動脈のカニューレ挿入中の血流の一時的な閉塞に必要です。したがって、緩い結び目を結び、両縫合糸の端をサージカルテープで固定します。 頭蓋と尾の咬合縫合糸の間に3番目の縫合糸(固定縫合糸)を配置し、緩い結び目を作ります(図2I)。この縫合糸は、動脈をカニューレ挿入している間、カテーテルを所定の位置に保つために必要です。縫合糸の一方の端を手術台にテープで固定します。 左総頸動脈のカニュレーション。注意: 血圧カテーテルのセンサー領域は遠位端から4 mmの場所にあり、非圧縮性流体と生体適合性ゲルを含むチューブで構成されています(図2B)。この部分は非常に敏感なので、気泡がないことを確認し、手順中はいつでも触れないでください。24Gの針の先端を~100°の角度に曲げて、カテーテル導入器として使用します。 尾側咬合縫合糸をそっと引っ張り、緊張させて一時的に血流を止め、動脈をわずかに持ち上げます。 曲がった針で頭蓋閉塞縫合糸の近位の動脈を注意深く貫通します(図2J)。血管カニューレ鉗子でカテーテルをつかみ、小さな穿刺に導入し、ゆっくりと血管内にスライドさせます。曲がった針を同時にゆっくりと引き戻します(図2K)。 カテーテルが尾側閉塞縫合糸に到達したら、固定縫合糸をわずかに締めて、カテーテルを所定の位置に保ちます(図2L)。 尾側閉塞縫合糸を緩めて、カテーテルの先端が大動脈弓に配置されるまでカテーテルをさらに動かせるようにします。注意: カテーテルの正しい挿入長さはマウスのサイズに依存するため、必ず決定してください。12週齢でC57BL/6Jのバックグラウンドを持ち、体重が~30 gのオスマウスの場合、統合されたノッチが頭蓋閉塞縫合糸に達するまでカテーテルを挿入することをお勧めします。特定のマウスラインに対するカテーテルの正しい挿入深さおよび配置は、動物の安楽死後に確認することができる。 適切に配置されたら、3つの縫合糸すべてでカテーテルを固定し、両端をできるだけ短く切ります。壊れやすい血圧カテーテルを損傷する可能性があるため、結び目をきつく引っ張りすぎないでください。 図2:ECGと血圧トランスミッタを組み合わせた移植-左頸動脈のカニューレ挿入 。 (A)テレメトリ送信機は、圧力カテーテル、2つの生体電位電極、およびデバイス本体で構成されています。(B)圧力カテーテルの概略図。センサー領域は、非圧縮性流体と生体適合性ゲルで構成されています。血管内の適切な位置を確保するために、ノッチが頭蓋閉塞縫合糸のレベルになるまで、カテーテルを頸動脈に挿入する必要があります。(C)手術用伝達物質移植用に調製した麻酔付きC57BL/6Jマウス。(D-L)左頸動脈のカニューレ挿入のための外科的処置を示す画像配列。(D)頸部皮膚切開。(E)気管に対して横方向に位置する左頸動脈を特定するための露出気管。(F)動脈を隣接組織および迷走神経から隔離するための鈍的解剖。(G)頭蓋閉塞縫合による左頸動脈の永久結紮。(H)一時的に血流を止めるために尾側閉塞縫合糸に張力をかける。(I)カニューレ挿入中にカテーテルを所定の位置に保つために縫合糸を固定します。(J)血管にカテーテルを挿入するための湾曲した先端を有するカニューレ。(K)頸動脈に圧力カテーテルを挿入する。(L)カテーテルの先端は大動脈弓に配置され、カテーテルは中央の縫合糸で固定されています。D-Lのスケールバーは4mmを示し、16から転載。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 マウスの左脇腹の皮下ポケットへのテレメトリ デバイス本体の配置 (図 3)。動物の左脇腹に向けられた首から皮下トンネルを形成し、小さくて鈍い解剖ハサミを使用して小さなポーチを形成します(図3B)。 温かい滅菌0.9%NaCl溶液で満たされた1 mLシリンジでトンネルを洗浄し、~300 μLの溶液をパウチに入れます(図3C)。 鈍い鉗子で皮膚を慎重に持ち上げ、送信機デバイス本体をポーチに入れます(図3D)。このステップでは、血圧カテーテルを頸動脈から引き抜かないように十分に注意してください。 アイントホーフェンII構成でのECGリードの配置。鈍い解剖ハサミで右胸筋に細いトンネルを形成し、鈍い鉗子を使用して負の(無色の)リードをトンネルに入れます。6-0吸収性縫合材料を使用して胸筋にステッチでリードの末端を固定します(図3E)。 正(赤)リードにループを形成し、その先端を左尾肋骨領域に配置し、6-0吸収性縫合材料を使用して縫合糸でその位置を固定します。注意: 組織の刺激を避けるために、両方のリード線が全長にわたって体に対して平らに置かれていることが重要です(図3F)。 5-0非吸収性縫合材料を使用して、シングルノットで皮膚を閉じます(図3H)。さらに、動物が縫合糸を噛まないようにし、裂開を防ぐために、すべての結び目に少量の組織接着剤を塗布します。 回復段階の創傷感染を防ぐために、ポビドンヨードヒドロゲルを創傷に10%塗布する。 先制的な痛みを和らげるために、マウスがまだ麻酔下にある間に、0.9%NaClに5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。. 加熱プラットフォームを39 ± 1°Cに設定し、マウスを別のハウジングケージに入れます。ケージの半分を手術後12時間プラットフォームに配置し、マウスを暖かい場所に移します。動物が麻酔から目覚めたとき、それは暖かい場所にとどまるか、ケージのより涼しい部分に移動するかの選択肢があります。 図3:ECGと血圧トランスミッタを組み合わせた移植-ECG電極とデバイス本体の皮下配置。 (a)血圧カテーテル挿入後のマウス。カテーテル位置は、閉塞縫合糸によって確保される。(B)鈍いハサミで動物の左脇腹に皮下ポケットを形成する。(C)パウチに~300μLの温かい滅菌生理食塩水で洗浄します。(D)デバイス本体を皮下ポケットに入れる。(e)負極(無色)の末端を吸収性縫合材で右胸筋に固定する。(F)正極(赤)を左肋間筋に固定する。(G)ECG電極の位置を確保するために胸筋に永久縫合糸を配置する。(H)皮膚閉鎖後のマウス。ECG電極チップの皮下位置は赤い円で示されています。デモンストレーションの目的で、死んだ動物を使用してこれらの画像を撮影しました。生きている動物を使用している間は、無菌の慣行に従ってください。16から転載。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 術後ケア術後の痛みを和らげるために、傷が治癒するまで12時間ごとに3〜5日間、0.9%NaClに5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。. 動物を脱水から保護するために、10 μL / gの温かいリンゲル乳酸溶液を腹腔内に注入します。. 最初のテレメトリ測定を実行する前に、マウスを2〜3週間回復させます。回復期間中の一般的な健康状態、創傷治癒、体重、および食物と水の摂取量を注意深く監視します。 実験の終わりに、二酸化炭素(CO2)吸入によってマウスを安楽死させる。注:頸部脱臼または断頭は、ECGおよびBP送信機デバイスの一部を損傷する可能性があるため、安楽死法としては推奨されません。 データ取得。データ記録中の音響ノイズや電子ノイズを避けるための対策を講じてください。さらに、データ記録中の人員のアクセスを制限し、実験前にすべての飼育手順を完了してください。 動物のケージをテレメトリーレシーバープレートに置き、磁石を動物に近づけてテレメトリトランスミッターをオンにします。 データ収集ソフトウェアを使用して、72時間(12時間の暗/明サイクル)にわたって継続的なECG、血圧、および活動記録を取得します(図4)。 心拍数、血圧、活動の概日リズムの分析。データ収集ソフトウェア12 を用いて、HR、BPおよび活動の規則的な概日リズムの存在を確認する(図5)。 ECGおよびBP分析ソフトウェアを使用したシーケンス法を使用した圧受容器感度の決定を含むデータ分析。BPおよびHRデータをデータ収集ソフトウェアからECGおよびBP分析ソフトウェアにエクスポートします(補足ファイル2)。次の一連のコマンドを使用します。 ECGおよびBP分析ソフトウェアを開く >ファイル > コンバーターからの生データ > 非IOX生データを変換します。新しいウィンドウで、[ファイル]をクリックして >データクエストART4データをロードします。再び、新しいウィンドウが開き、 エクスポートするデータファイルを選択し>新しいウィンドウが開き、「被験者」リストから動物を選択し、「波形リスト」からECGとBPを選択して OKを押します。[ データの変換] > [IOX バイナリ サイト ファイルの作成] をクリックして、データの変換元の動物を選択します。 以下の一連のコマンドを使用して、ECGおよびBP分析ソフトウェアでIOXバイナリサイトファイルを開きます。 ファイル> IOXデータをロード>BPおよびECGトレースを選択し>緑色のチェックマークを押します。注:以下のデータ処理パラメータは、野生型マウスから取得したデータ用に最適化されており、原則として前臨床分野で使用されるすべてのマウスモデルに適合する必要があります。ただし、特定の実験モデル、たとえば、HR値および/またはBP値が非常に高いまたは低いマウス、または異なるげっ歯類種で作業する場合は、これらのパラメーターの適応が必要になる場合があります。いずれにせよ、データ処理パラメータは、調査中の特定のモデルに適合することを保証するために慎重に検討する必要があります。 ECG、BP、およびBRS分析の設定については、補足ファイル3,4を参照してください。マウスでのBRS分析では、SBPと1拍のRRの間の遅延を示す3つ(またはそれ以上)の拍動のシーケンスのみを検出するようにBRSパラメーターを調整し、SBPおよびRRの変化のしきい値を0.5 mmHgおよび2 msに設定します。RR/SBPプロットからの回帰直線の傾きの相関係数が0.75より大きいことを確認し、安定した洞調律を示すセクションのみを解析します。ECG、BP、およびBRS分析のパラメータを適宜設定するには、以下の一連のコマンドを使用します。 新しいウィンドウが開く>>分析設定を調整する心電図設定(「心電図モードと信号フィルタリング」ウィンドウ(補足ファイル3)を右クリックします)。ここで詳しく説明するようにパラメータを設定します。モード: ECG, RRのみ, フィルターモード: 自動, 設定HRによる, 予想心拍数: bpm > 300, ベースライン除去フィルター幅 (ms): 100.00, ノイズ除去フィルター幅: 1.00 ms, ノッチフィルター: 50.0 Hz, スパイク除去フィルター: オフ, ドロップアウト検出モード: オフ, 最大 RR 長 (ms): 900.00, 調整済み R ピークからの RR: オフ, RR_only設定モード: Xsmall: マウス、Rピーク幅(ミリ秒):10.00、PR幅(ミリ秒):20.00、RT幅(ミリ秒):50.00、最大インタービートアーティファクト(%):50.00、Rと他の振幅比:3.00、Rピーク符号:正、および追加パラメータの計算:オフ 血圧設定(血圧、圧力設定)については、「BPアナライザー」ウィンドウ(補足ファイル4)を右クリックします。ここで詳しく説明するようにパラメータを設定します。ノイズ除去フィルタ幅(ms): 10.00, 微分フィルタ幅(ms): 6.00, ノッチフィルター: 50.0 Hz, スパイク除去フィルター: オフ, 検証しきい値(口径単位): 12.00, 除去しきい値: 8.00, 開始時微分アップストローク(cal U/s): 10.00, 除去限界: オフ, 基準心電図からの遅延: ユーザー定義ウィンドウ, ECG Rピークからの最小遅延 (ms): 10.00, ecg Rpeak からの最大遅延 (ms): 250.00, マークからのConduct_time_1: 計算されていません, マークからConduct_time_2: 計算されていません, BR (呼吸数): オフ, BRS (気圧反射感度): オン, 最小連続拍数: 3, レイテンシ拍数: 1, 圧力値: SBP, パルス間隔を計算するマーク: R, 最小圧力変動 (caIU): 0.50, 最小間隔変動 (ms): 2.00, 最小相関: 0.75 低活性の3時間シーケンスの活性信号をスクリーニングします。動物の高い活性がBPおよびRR相関を妨げるので、この時間枠でBRS分析を実行する。 この3時間の時間枠でBPおよびRR分析を実行し、3時間の分析を10分ステップに分割します。 次のコマンドのシーケンスを使用して、BRS 分析を実行します。 BRS 分析 ウィンドウを開き> BRS 分析>ビューを開きます。BRS 分析パネルが開きます。BRS分析パネルに表示されるすべてのシーケンスを手動で検査し、異所性拍動、洞休止、不整脈イベント、またはノイズの多いデータを除外します。このようなシーケンスのすべてのビートを無効にして、分析から正常に除外してください。 BRS 解析の結果をスプレッドシート ファイル(結果ファイル)にエクスポートします。スプレッドシート ファイルにエクスポートされるパラメーターを変更するには、次のコマンド (補足ファイル 5-7) を使用します。txt (補足ファイル 5) >リスト/ファイル>セクションの>パラメーターを調整します。「ビート」セクションと、無効化されたビートセクション以外の関心のある情報を含むその他のセクションを選択します。 リスト/ファイルへの>ステップで>パラメーターをtxt>調整 します(補足ファイル6)。エクスポートするステップ値を選択します。 リスト/ファイル内の>パラメータを調整>-> txt (補足ファイル7)を打ち負かします。 ファイルの beats セクションに、すべてのビートについて少なくとも次のデータが含まれていることを確認します。ECG_RR、ECG_HR、BP_SBP、BP_BRS_deltaP、BP_BRS_#(=シーケンスの連続した拍音間隔)、BP_BRS_slope、BP_BRS_correl、BP_BRS_shiftl(=後続の拍のRR) 次に 、[ファイル] > [結果ファイルの保存] をクリックします。 エクスポートしたデータをExcelのフィルター機能(補足ファイル8)で上下のシーケンスにソートします。シーケンスの数、平均BRSスロープ、標準偏差、BRSスロープの標準誤差をアップシーケンスとダウンシーケンスで別々に計算します。また、1000ビートあたりのシーケンスの合計量を計算します。注:アップシーケンスとダウンシーケンスの自動ソートと分析のためのスプレッドシートテンプレート(TemplateBRS)は、補足(補足ファイル8)で提供されており、分析を容易にします。フィルター機能を調整することで、異なるビート番号(3ビートまたは4ビートシーケンスなど)でシーケンスを並べ替えることができます。詳細については、補足ファイル 9-13 を参照してください。結果ファイルとテンプレート BRS エクセル ファイル (補足ファイル 8) を開きます。結果ファイルから次の列のデータをコピーします: (圧力)_BRS_deltaP、(圧力)_BRS_# および (圧力)_BRS_slope (補足ファイル 9)。TemplateBRS ファイル (補足ファイル 10) の “アップ シーケンス” スプレッドシートと “ダウン シーケンス” スプレッドシートのそれぞれの列にデータを貼り付けます。さらに、結果ファイル (補足ファイル 11) から列 (圧力) _BRS_SBP のデータをコピーし、TemplateBRS ファイル (補足ファイル 12) の “すべてのシーケンス” スプレッドシートに貼り付けます。注: (圧力)_BRS_# 列の数字は、シーケンスの最後のビートにのみリストされ、シーケンスの長さを示します。アップシーケンスとダウンシーケンスは、(圧力)_deltaP値の符号で区別できます。3 拍シーケンスの 2 拍目と 3 拍目の負の値は、ダウンシーケンスを示します。正の値は、それぞれアップシーケンスを示します。 コピーしたデータを既定のフィルター設定でフィルター処理します。(圧力)_BRS_#列のフィルターアイコンをクリックし、「OK」(補足ファイル13)を押します。この手順を「アップシーケンス」および「ダウンシーケンス」スプレッドシートに適用します。注:スプレッドシートは3ビートシーケンスをフィルタリングします。他のシーケンス長が要求される場合は、ドロップダウンメニューでこの列の設定を変更する必要があります。シーケンス数、平均BRS勾配、標準偏差、BRS勾配の標準誤差の計算は、「アップシーケンス」および「ダウンシーケンス」スプレッドシートの緑色のボックスに表示されます。1000ビートあたりのシーケンスの総数の計算は、「すべてのシーケンス」スプレッドシートの緑色のボックスに表示されます。