Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Ren&#233; D. R&#246;tzer; Verena F. Brox; Konstantin Hennis; Stefan B. Thalhammer; Martin Biel; Christian Wahl-Schott; Stefanie Fenske

doi:10.3791/62101

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicine

השתלת משדרי אק"ג ולחץ דם טלמטריים משולבים לקביעת רגישות ספונטנית לברפלקס בעכברים מודעים

Published: February 14, 2021

doi:

10.3791/62101

René D. Rötzer¹, Verena F. Brox¹, Konstantin Hennis¹, Stefan B. Thalhammer¹, Martin Biel^1,2, Christian Wahl-Schott³, Stefanie Fenske^1,2

¹Center for Integrated Protein Science (CIPS-M) and Center for Drug Research, Department of Pharmacy,Ludwig-Maximilians-Universität München, ²German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance, ³Hannover Medical School,Institute for Neurophysiology

Summary

הברופלקס הוא מנגנון ויסות קצב הלב על ידי מערכת העצבים האוטונומית בתגובה לשינויים בלחץ הדם. אנו מתארים טכניקה כירורגית להשתלת משדרי טלמטריה למדידה רציפה וסימולטנית של אלקטרוקרדיוגרמה ולחץ דם בעכברים. זה יכול לקבוע רגישות ספונטנית baroreflex, סמן פרוגנוסטי חשוב למחלות לב וכלי דם.

Abstract

לחץ דם (BP) וקצב לב (HR) נשלטים שניהם על ידי מערכת העצבים האוטונומית (ANS) והם שזורים זה בזה באופן הדוק עקב מנגנוני רפלקס. הברופלקס הוא מנגנון הומיאוסטטי מרכזי לנטרול שינויים חריפים וקצרי טווח ב-BP העורקי ולשמירה על BP בטווח פיזיולוגי צר יחסית. BP מורגש על ידי baroreceptors הממוקם בקשת אבי העורקים ובסינוס התרדמה. כאשר BP משתנה, אותות מועברים למערכת העצבים המרכזית ולאחר מכן מועברים לענפים הפאראסימפתטיים והסימפתטיים של מערכת העצבים האוטונומית כדי להתאים את HR. עלייה ב- BP גורמת לירידה רפלקס ב- HR, ירידה ב- BP גורמת לעלייה רפלקס ב- HR.

רגישות Baroreflex (BRS) היא הקשר הכמותי בין שינויים ב- BP עורקי לבין שינויים מקבילים ב- HR. מחלות לב וכלי דם קשורות לעיתים קרובות לתפקוד לקוי של baroreflex. במחקרים שונים BRS מופחת דווח למשל באי ספיקת לב, אוטם שריר הלב או מחלת עורקים כליליים.

קביעת BRS דורשת מידע הן מ- BP והן מ- HR, אשר ניתן להקליט בו זמנית באמצעות מכשירים טלמטריים. ההליך הכירורגי מתואר החל מהחדרת חיישן הלחץ לעורק התרדמה השמאלי ומיקום קצהו בקשת אבי העורקים כדי לפקח על לחץ העורקי ולאחר מכן מיקום תת עורי של המשדר ואלקטרודות האק”ג. אנו מתארים גם טיפול נמרץ לאחר הניתוח וניהול משככי כאבים. לאחר תקופה של שבועיים של התאוששות לאחר הניתוח, רישומי אק”ג ו-BP ארוכי טווח מבוצעים בעכברים בהכרה וללא מעצורים. לבסוף, אנו כוללים דוגמאות של הקלטות באיכות גבוהה וניתוח של רגישות baroreceptor ספונטני באמצעות שיטת רצף.

Introduction

רפלקס הברורצפטור העורקי הוא מערכת בקרת המשוב העיקרית בבני אדם המספקת שליטה לטווח קצר – ואולי^{גם לטווח ארוך} יותר ^1,2 – על לחץ הדם העורקי (ABP). רפלקס זה חוצץ הפרעות ב- BP המתרחשות בתגובה לגורמים פיזיולוגיים או סביבתיים. הוא מספק שינויים רפלקס מיידיים בקצב הלב, נפח שבץ והתנגדות עורקים היקפית כוללת. מקורו של הרפלקס בקצות העצבים התחושתיים בקשת אבי העורקים ובסינוסים של התרדמה. מסופי עצבים אלה מרכיבים את הברצפטורים העורקיים. הסומטה של מסופי העצבים בקשת אבי העורקים ממוקמים בגנגליון הנודוזה ואילו אלה של מסופי העצבים בסינוס התרדמה ממוקמים בגנגליון הפטרוסלי. הרפלקס מופעל על-ידי עלייה בלחץ הדם, אשר מותחת ומפעילה את קצות העצבים של הבררצפטור (איור 1A). ההפעלה גורמת למטחים פוטנציאליים לפעולה המועברים באופן מרכזי דרך מדכא אבי העורקים האפרנטי ועצבי סינוס התרדמה לגרעיני גזע המוח הקרדיווסקולריים כגון גרעין טרקטוס סוליטרי והגרעין הגבי של העצב הואגלי. שינויים בפעילות העצבית האפרנטית בתורו מווסתים את הפעילות האוטונומית הגמישה. פעילות מוגברת של עצבי baroreceptor מפחיתה את הפעילות הסימפתטית ומגבירה את הפעילות העצבית הפאראסימפתטית. לפיכך, ההשלכות של הפעלת baroreceptors הן ירידה בקצב הלב, תפוקת הלב, ואת התנגדות כלי הדם אשר יחד לנטרל ולאגור את העלייה בלחץ הדם³. לעומת זאת, ירידה בפעילות העצבים הברורצפטורים מגבירה את הפעילות הסימפתטית ומפחיתה את הפעילות העצבית הפאראסימפתטית, מה שמגביר את קצב הלב, תפוקת הלב ותנגודת כלי הדם ובכך מנטרל את הירידה בלחץ הדם.

מחקרים רבים בבני אדם ובבעלי חיים הוכיחו כי ניתן להתאים את רפלקס הברורצפטור בתנאים פיזיולוגיים כגון פעילות גופנית⁴, שינה⁵, לחץ חום⁶ או הריון⁷. בנוסף, ישנן עדויות לכך שהברפלקס נפגע באופן כרוני במחלות לב וכלי דם, כגון יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, אוטם שריר הלב ושבץ. למעשה, תפקוד לקוי של baroreflex משמש גם כסמן פרוגנוסטי במספר מחלות לב וכלי דם ^8,9,10. יתר על כן, תפקוד לקוי של baroreflex קיים גם הפרעות של ANS. בהתחשב בחשיבותו של רפלקס הברורצפטור למצבי בריאות ומחלות, הערכת in vivo של רפלקס זה היא מרכיב חשוב במחקר אוטונומי וקרדיווסקולרי עם השלכות קליניות חמורות מסוימות.

קווי עכברים גנטיים הם כלים חיוניים במחקר לב וכלי דם. מחקרי In vivo של קווי עכברים כאלה מספקים תובנות חשובות על פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של הלב וכלי הדם, ובמקרים רבים משמשים כמערכות מודל פרה-קליניות למחלות לב וכלי דם. כאן אנו מספקים פרוטוקול לרישום טלמטרי in vivo ECG ו-BP בעכברים מודעים, בלתי מרוסנים ונעים בחופשיות, ומתארים כיצד ניתן לקבוע רגישות ל-baroreflex מהקלטות אלה באמצעות שיטת הרצף (איור 1B). השיטה המיושמת נקראת שיטת הרצף, מכיוון שסדרת פעימות לפעימה של מרווחי BP סיסטולי (SBP) ו- RR נבדקות עבור רצפים קצרים של שלוש פעימות או יותר במהלך עלייה או ירידה ספונטנית ב- SBP עם הסתגלות רפלקס של HR. שיטה זו היא תקן הזהב לקביעת רגישות baroreflex מאז רק מנגנוני רפלקס ספונטניים נחקרים. הטכניקה עדיפה על טכניקות ישנות יותר שכללו הליכים פולשניים כגון הזרקה של תרופות vasoactive כדי לגרום לשינויים BP.

איור 1: ייצוג סכמטי של הערכת רגישות baroreflex ו- baroreflex באמצעות שיטת הרצף . (A) מהלך הברפלקס במהלך עלייה חריפה בלחץ הדם. עלייה קצרת טווח ב- ABP מורגשת על ידי baroreceptors הממוקם בקשת אבי העורקים ובסינוס התרדמה. מידע זה מועבר למערכת העצבים המרכזית וגורם לירידה בפעילות העצבים הסימפתטיים במקביל לעלייה בפעילות הפאראסימפתטית. שחרור אצטילכולין מקצות העצבים הממוקמים באזור הצומת הסינואפרוזדורי גורם לירידה של cAMP השליח השני בתאי קוצב הצומת הסינואפרוזדורי ומכאן לירידה בקצב הלב. לירידה קצרת טווח בלחץ הדם יש השפעה הפוכה. (B) מעקב סכמטי של BP במהלך רצף למעלה (לוח שמאלי עליון) ורצף למטה (לוח ימני עליון) של שלוש פעימות רצופות. רצף למעלה קשור לעלייה מקבילה במרווחי RR (פאנל שמאלי תחתון) המקבילה לירידה ב- HR. רצף למטה קשור לירידה מקבילה במרווחי RR (פאנל ימני תחתון) המקבילה לעלייה במשאבי אנוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

לבצע את כל הניסויים בבעלי חיים בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות ולחוקים הלאומיים בנושא ניסויים בבעלי חיים. עבור ניסוי זה, המחקרים אושרו על ידי Regierung von Oberbayern והיו בהתאם לחוקים הגרמניים על ניסויים בבעלי חיים. חיות WT (רקע C57BL/6J) ובעלי חיים של עכבר עם תסמונת סינוס חולה המציגים רגישות מוגברת ל-BRS (Hcn4tm3 (Y527F; R669E; T670A)Biel)11 (רקע מעורב של C57BL/6N ו-129/SvJ) שימשו במחקר זה. 1. הגדרת ציוד מוציאים משדר טלמטרי מהאריזה הסטרילית שלו ומקצרים את האק”ג לאורך המתאים לגודל העכבר. עבור עכבר שחור שחור בן 12 שבועות (C57BL/6J), השוקל ~30 גרם, קצר את העופרת החיובית (אדום) לאורך של ~45 מ”מ ואת העופרת השלילית (חסרת צבע) לאורך של ~40 מ”מ באמצעות מספריים.הערה: ערכים אלה ניתנים ככיוון ויש להתאים אותם לפי הצורך (איור 2). הסר כ-6 מ”מ מצינור הסיליקון של מוליך האק”ג באמצעות אזמל כדי לחשוף את החוט. כסה את קצות החוט עם צינורות מוגזמים והשאיר חלק ~ 2 מ”מ של חוט אק”ג חשוף כדי להקליט אותות חשמליים. הדקו את צינורות הסיליקון עם חומר תפר משי 5-0 שאינו נספג (איור 2A). רשום את המספר הסידורי של המשדר בפרוטוקול הפעולה (קובץ משלים 1). לחות המשדר בתמיסת NaCl חמה וסטרילית של 0.9%. שקלו את העכבר ותיעדו את משקלו. אוטוקלאבים את כל כלי הניתוח לפני הניתוח. יש לעקר אותם במהלך הניתוח ובין ניתוח בעלי חיים שונים בחום יבש באמצעות מעקר חרוזי זכוכית חם.הערה: מכשירי ניתוח חייבים להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע כוויות עור. יש לחטא את ספסל העבודה כדי להבטיח תנאים אספטיים. 2. השתלה כירורגית של משדרים טלמטריים למדידות משולבות של אק”ג ולחץ דם דיסקציה של עורק התרדמה המשותף השמאלי.מרדימים עכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של תערובת הרדמה (100 מ”ג/ק”ג קטמין; 15 מ”ג/ק”ג קסילזין; 1 מ”ג/ק”ג אצפרומזין). בצע בדיקת צביטת בוהן כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין לפני תחילת הניתוח. השתמש בגוזם כדי לגלח את אזור הניתוח מתחת לסנטר לכיוון שרירי החזה הרוחביים. הניחו את העכבר במצב שכיבה על צלחת ניתוח מבוקרת טמפרטורה המוגדרת לטמפרטורה של 37°C. אבטחו את הגפיים בעזרת סרט כירורגי ונטרו ברציפות את טמפרטורת הגוף באמצעות מדחום רקטלי (איור 2C). אם טמפרטורת הגוף יורדת מתחת ל -37 מעלות צלזיוס, יש לכסות את גוף בעל החיים בגזה סטרילית מכותנה במהלך הניתוח. יש למרוח משחת עיניים כדי להגן על עיני בעל החיים במהלך ההרדמה. יש למרוח קרם דפילטורי על אזור הניתוח שגולח בעבר. יש להסיר את השיער ואת קרם הניקוי בעזרת פד צמר גפן ומים חמימים לאחר 3-4 דקות. יש לוודא כי העור נקי ונקי משאריות שיער וקרם דפילטורי, כך שהפצע לא יזוהם במהלך הניתוח. לחטא את העור עם כמה סיבובים לסירוגין של povidone-יוד או chlorhexidine לשפשף ואחריו אלכוהול. מקמו את בעל החיים מתחת למיקרוסקופ מנתח והניחו וילון סטרילי סביב אזור הניתוח. בצע חתך קו אמצע של 1-1.5 ס”מ דרך עור הצוואר, החל מיד מתחת לסנטר. יש להתאמץ ולהפוך את החתך לישר ככל האפשר. (איור 2D).הערה: במהלך השלבים הבאים, אזור הניתוח חייב להישמר לח על ידי יישום קבוע של סטרילי, חם (37 ° C) 0.9% NaCl. יצירת רווח תת עורי משני צידי החתך על ידי הפרדת העור מרקמת החיבור שמתחתיו באמצעות מספריים לדיסקציה קהה. היזהר לא לצבוט את העור חזק מדי עם המלקחיים, שכן זה יכול לגרום נמק ולהוביל ריפוי פצע לקוי לאחר הניתוח. להפריד את בלוטות parotid ו submandibular באמצעות אפליקטורים קצה כותנה לחשוף את השרירים מעל קנה הנשימה. משכו את בלוטת הרוק השמאלית בעזרת מלקחיים מעוקלים כדי לזהות את עורק התרדמה השמאלי הממוקם לרוחב קנה הנשימה (איור 2E). נתחו בזהירות את עורק התרדמה מרקמה סמוכה באמצעות מלקחיים מעוקלים. היזהר מאוד לא לפגוע בעצב הווגאלי שפועל לאורך כלי השיט. המשיכו בדיסקציה קהה כדי לחשוף את עורק התרדמה השמאלי לאורך של כ-10 מ”מ ולהפריד אותו לחלוטין מהפאשיה של כלי הדם ומהעצב התועה (איור 2F). מעבירים תפר משי 5-0 שאינו נספג מתחת לחלק המבודד של עורק התרדמה תוך הרמה קלה של כלי הדם עם מלקחיים מעוקלים כדי להפחית את החיכוך בין התפר לעורק התרדמה, שכן הדבר עלול לפגוע בקלות בדופן כלי הדם. הניחו את התפר בצורה גולגולתית, ממש בסמיכות לביפורקציה של עורק התרדמה, צרו קשר וקשרו אותו כדי לקשור את כלי הדם לצמיתות (איור 2G). תקן את שני הקצוות של תפר חסימת הגולגולת לשולחן הניתוח עם סרט ניתוח. העבירו תפר חסימה שני מתחת לעורק התרדמה והניחו אותו במרחק ~5 מ”מ לתפר הגולגולת (איור 2H). זה נחוץ לחסימה זמנית של זרימת הדם במהלך קנולציה של העורק. לכן, לקשור קשר רופף ולתקן את שני קצוות התפר עם סרט כירורגי. מקמו תפר שלישי (תפר מאובטח) בין תפר החסימה הגולגולתי לתפר הקאודלי וצרו קשר רופף (איור 2I). תפר זה נחוץ כדי לשמור על הצנתר במקומו תוך כדי קנולציה של העורק. הדביקו קצה אחד של התפר לשולחן הניתוחים. קנולציה של עורק התרדמה המשותף השמאלי.הערה: אזור החיישן של צנתר לחץ הדם ממוקם 4 מ”מ מהקצה הדיסטלי ומורכב מצינור המכיל נוזל שאינו ניתן לדחיסה וג’ל תואם ביולוגית (איור 2B). מכיוון שאזור זה רגיש מאוד, יש לוודא שהוא נקי מבועות אוויר ואל תיגע בו בכל עת במהלך ההליך.כופפו את קצה מחט 24 G לזווית של ~100° כדי להשתמש בה כמכנס קטטר. משוך בעדינות את תפר החסימה הקאודלי וקבע אותו במתח כדי לעצור זמנית את זרימת הדם ולהרים מעט את העורק. חדרו בזהירות את העורק הפרוקסימלי לתפר חסימת הגולגולת עם המחט המכופפת (איור 2J). אוחזים את הצנתר במלקחיים לקנולציה, מכניסים אותו לנקב הקטן ונותנים לו להחליק לאט לתוך הכלי. משכו בעדינות את המחט המכופפת לאחור בו-זמנית (איור 2K). כאשר הצנתר מגיע לתפר החסימה הקאודלית, הדקו מעט את התפר המאובטח כדי לשמור על הצנתר במקומו (איור 2L). שחררו את תפר החסימה הקאודלי כך שניתן יהיה להזיז את הצנתר עוד יותר עד שקצהו ממוקם בקשת אבי העורקים.הערה: הקפד לקבוע את אורך ההחדרה הנכון של הצנתר, מכיוון שהדבר תלוי בגודל העכבר. עבור עכברים זכרים עם רקע C57BL/6J בגיל 12 שבועות ו~30 גרם משקל גוף, אנו ממליצים להחדיר את הצנתר עד שהחריץ המשולב מגיע לתפר חסימת הגולגולת. ניתן לאמת את עומק ההחדרה והמיקום הנכון של הצנתר לקו העכבר הספציפי לאחר המתת חסד של החיה. לאחר מיקום נכון, לאבטח את הצנתר עם כל שלושת התפרים לחתוך את הקצוות קצר ככל האפשר. אין למשוך את הקשרים חזק מדי מכיוון שהדבר עלול לפגוע בצנתר לחץ הדם השביר. איור 2: השתלת משדר משולב של אק”ג ולחץ דם – קנולציה של עורק התרדמה השמאלי . (A) משדר הטלמטריה מורכב מצנתר לחץ, שתי אלקטרודות ביו-פוטנציאליות ומגוף המכשיר. (B) ייצוג סכמטי של צנתר הלחץ. אזור החיישן מורכב מנוזל שאינו ניתן לדחיסה וג’ל תואם ביולוגית. יש להחדיר את הצנתר לעורק התרדמה עד שהחריץ נמצא ברמה של תפר חסימת הגולגולת כדי להבטיח מיקום תקין בכלי הדם. (C) עכבר C57BL/6J מורדם המוכן להשתלת משדר כירורגי. (ד-ל) רצף תמונות המציג הליך כירורגי לקנולציה של עורק התרדמה השמאלי. (D) חתך בעור צוואר הרחם. (E) קנה נשימה חשוף לזיהוי עורק התרדמה השמאלי הממוקם לרוחב קנה הנשימה. (F) דיסקציה קהה כדי לבודד את העורק מרקמה סמוכה ומהעצב התועה. (G) קשירה קבועה של עורק התרדמה השמאלי עם תפר חסימת גולגולת. (H) מתח המופעל על תפר חסימה קאודלי כדי לעצור זמנית את זרימת הדם. (I) תפר מאובטח כדי לשמור על הצנתר במקומו במהלך הקנולציה. (J) קנולה עם קצה מעוקל להחדרת הצנתר לכלי הדם. (K) צנתר לחץ מוחדר לעורק התרדמה. (L) קצה הצנתר ממוקם בקשת אבי העורקים והצנתר מאובטח בתפר האמצעי. סרגל קנה מידה ב-D – L מראה 4 מ”מ. הודפס מחדשמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. מיקום גוף מכשיר הטלמטריה בכיס תת-עורי בצד השמאלי של העכבר (איור 3).יוצרים תעלה תת-עורית מהצוואר המכוונת לכיוון האגף השמאלי של החיה ויוצרים כיס קטן באמצעות מספריים קטנים וקהים לניתוח (איור 3B). השקו את המנהרה עם מזרק 1 מ”ל מלא בתמיסת NaCl חמה וסטרילית של 0.9% והכניסו ~300 μL של התמיסה לתוך השקית (איור 3C). הרימו בזהירות את העור בעזרת מלקחיים קהים והכניסו את גוף המכשיר המשדר לתוך השקית (איור 3D). במהלך שלב זה, היזהר מאוד לא למשוך את קטטר לחץ הדם מעורק התרדמה. מיקום מוליכי האק”ג בתצורת איינטהובן II.יוצרים תעלה דקה לשריר החזה הימני בעזרת מספריים מנתחים קהים ומניחים את העופרת השלילית (חסרת הצבע) לתוך המנהרה באמצעות מלקחיים קהים. תקנו את הקצה הסופי של העופרת באמצעות תפר לשריר החזה באמצעות 6-0 חומר תפר נספג (איור 3E). יוצרים לולאה בעופרת החיובית (האדומה), מקמים את קצהו באזור הצלעות הקאודלי השמאלי ומבססים את מקומה באמצעות תפר באמצעות חומר תפר נספג 6-0.הערה: חשוב ששני העופרים ישכבו שטוחים כנגד הגוף לכל אורכם כדי למנוע גירוי ברקמה (איור 3F). סגרו את העור עם קשרים בודדים באמצעות 5-0 חומר תפר שאינו נספג (איור 3H). בנוסף, יש למרוח כמות קטנה של דבק רקמות על כל קשר כדי למנוע מהחיה לנשוך את התפר ולמנוע הלחשה. החל פובידון-יוד הידרוג’ל 10% על הפצע כדי למנוע זיהום הפצע בשלב ההחלמה. להקלה מקדימה על כאבים, יש להזריק 5 מ”ג/ק”ג קרפרופן ב-0.9% NaCl תת עורית בזמן שהעכבר עדיין תחת הרדמה. הגדר פלטפורמת חימום ל 39 ± 1 מעלות צלזיוס ומקם את העכבר בכלוב דיור נפרד. הניחו מחצית אחת של הכלוב על הרציף למשך 12 שעות לאחר הניתוח והעבירו את העכבר באזור החם. כאשר בעל החיים מתעורר מהרדמה, יש לו אפשרות להישאר באזור החם או לעבור לחלק הקריר יותר של הכלוב. איור 3: השתלת משדר משולב של אק”ג ולחץ דם – מיקום תת עורי של אלקטרודות האק”ג וגוף המכשיר . (A) עכבר לאחר החדרת קטטר לחץ הדם. מיקום הצנתר מאובטח על ידי התפרים החסימה. (B) יצירת כיס תת-עורי בצידו השמאלי של בעל החיים באמצעות מספריים קהים. (C) השקית מושקית ב~300 מיקרוליטר של מלח סטרילי חם. (ד) גוף המכשיר מונח בכיס התת עורי. (E) הקצה הסופי של האלקטרודה השלילית (חסר צבע) מקובע לשריר החזה הימני עם חומר תפר נספג. (F) קיבוע האלקטרודה החיובית (אדום) לשרירים הבין-קוסטליים השמאליים. (G) מיקום תפר קבוע על שריר החזה כדי להבטיח את מיקום אלקטרודות האק”ג. (H) עכבר לאחר סגירת העור. המיקומים התת עוריים של קצות אלקטרודות האק”ג מסומנים על ידי עיגולים אדומים. למטרות הדגמה, נעשה שימוש בחיה מתה כדי לצלם תמונות אלה. אנא הקפידו על שיטות סטריליות בעת שימוש בבעל חיים חי. הודפס מחדש מתוך16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. טיפול לאחר הניתוחלהקלה על כאבים לאחר הניתוח יש להזריק 5 מ”ג/ק”ג קרפרופן ב-0.9% NaCl תת עורית כל 12 שעות למשך 3-5 ימים עד לריפוי הפצע. יש להזריק 10 μL/g של תמיסת רינגר לקטט חמה תוך צפקית כדי להגן על בעל החיים מפני התייבשות. תן לעכבר להתאושש במשך 2-3 שבועות לפני הפעלת המדידות הטלמטריות הראשונות. עקוב בקפידה אחר מצבים בריאותיים כלליים, ריפוי פצעים, משקל גוף וצריכת מזון ומים במהלך תקופת ההחלמה. בסוף הניסוי, הרדימו את העכבר על ידי שאיפת פחמן דו חמצני (CO2).הערה: פריקת צוואר הרחם או עריפת ראשו אינה מומלצת כשיטת המתת חסד מכיוון שהדבר עלול לפגוע בחלקים של מכשיר המשדר אק”ג ו- BP. איסוף נתונים.נקוט אמצעים כדי למנוע רעש אקוסטי ואלקטרוני במהלך הקלטת נתונים. בנוסף, להגביל את הגישה של אנשי צוות במהלך רישום נתונים ולהשלים את כל הליכי הגידול לפני הניסוי. הניחו את הכלוב של בעל החיים על לוחית מקלט הטלמטריה והפעילו את המשדר הטלמטרי על ידי קירוב מגנט לחיה. רכשו רישומי אק”ג, לחץ דם ופעילות רציפים במשך 72 שעות (מחזור חושך/אור של 12 שעות) באמצעות תוכנה לרכישת נתונים (איור 4). ניתוח השעון הביולוגי של קצב הלב, לחץ הדם והפעילות.בדקו נוכחות של שעון ביולוגי קבוע של משאבי אנוש, BP ופעילות באמצעות תוכנהלרכישת נתונים 12 (איור 5). ניתוח נתונים כולל קביעת רגישות baroreceptor באמצעות שיטת רצף עם תוכנות ניתוח ECG ו- BP.ייצוא נתוני BP ומשאבי אנוש מתוכנה לרכישת נתונים לתוכנות ניתוח אק”ג ו-BP (קובץ משלים 2). השתמש ברצף הפקודות הבא: פתח את תוכנת ניתוח אק”ג ו- BP > נתוני קובץ > גולמיים מממיר > המרת נתונים גולמיים שאינם IOX. בחלון החדש, לחץ על File > Load Dataquest ART4 data. שוב, ייפתח חלון חדש, בחר קובץ נתונים לייצוא > נפתח חלון חדש, בחר חיה מרשימת “נושאים” ובחר אק”ג ו- BP מ”רשימת צורות גל” ולחץ על אישור. בחר בעלי חיים שמהם יש להמיר נתונים על-ידי לחיצה על המר נתונים > צור קובץ אתר בינארי של IOX. פתח את קובץ האתר הבינארי של IOX בתוכנת ניתוח ECG ו- BP באמצעות רצף הפקודות הבא: קובץ > טען נתוני IOX > בחר מעקב BP ו- ECG > לחץ על סימן הביקורת הירוק.הערה: פרמטרי עיבוד הנתונים הבאים ממוטבים לנתונים המתקבלים מעכברי בר ואמורים להתאים באופן עקרוני לכל דגמי העכבר המשמשים בתחום הפרה-קליני. עם זאת, התאמה של פרמטרים אלה עשויה להיות נחוצה בעת עבודה עם מודלים ניסיוניים ספציפיים, למשל, עכברים עם ערכי HR ו / או BP גבוהים או נמוכים במיוחד, או מיני מכרסמים שונים. בכל מקרה, פרמטרים של עיבוד נתונים צריכים להיבדק בקפידה כדי להבטיח שהם מתאימים למודל הספציפי הנחקר. לקבלת הגדרות עבור ניתוח אק”ג, BP ו- BRS, ראה קובץ משלים 3,4. עבור ניתוח BRS בעכברים, התאם את פרמטרי BRS כדי לזהות רק רצפים של שלוש פעימות (או יותר) המציגים השהיה בין SBP ו- RR של פעימה אחת, והגדר את הסף לשינוי SBP ו- RR ל- 0.5 מ”מ כספית ו- 2 אלפיות השנייה. ודא שמקדם המתאם של שיפוע קו הרגרסיה מחלקות RR/SBP גדול מ-0.75 וננתח רק קטעים המציגים קצב סינוס יציב. הגדר פרמטרים עבור ניתוח ECG, BP ו- BRS בהתאם באמצעות רצף הפקודות הבא: כוונון הגדרות ניתוח > > פתיחת חלון חדשהגדרות אק”ג (לחץ לחיצה ימנית בחלון “מצב אק”ג וסינון אותות” (קובץ משלים 3)). הגדר את הפרמטרים כמפורט כאן. מצב: אק”ג, RR בלבד, מצב מסנן: אוטומטי, בהתאם לדופק שהוגדר, קצב לב צפוי: פעימות לדקה > 300, רוחב מסנן להסרת קו בסיס (ms): 100.00, רוחב מסנן הסרת רעשים: 1.00 מטר/שניה, מסנן חריץ: 50.0 הרץ, מסנן הסרת ספייק: כבוי, מצב זיהוי נשירה: כבוי, אורך RR מרבי (ms): 900.00, RR מפסגות R מותאמות: כבוי, מצב הגדרות RR_only: Xsmall: עכבר, רוחב שיא R (ms): 10.00, רוחב יחסי ציבור (ms): 20.00, רוחב RT (ms): 50.00, חפץ אינטר פעימה מרבי (%): 50.00, R ליחס משרעת אחר: 3.00, R סימן שיא: חיובי, ופרמטר נוסף לחישוב: כבוי עבור הגדרות לחץ הדם (BP, הגדרות לחץ) לחץ לחיצה ימנית בחלון “BP אנלייזר” (קובץ משלים 4). הגדר את הפרמטרים כמפורט כאן. רוחב מסנן הסרת רעשים (ms): 10.00, רוחב מסנן נגזרת (ms): 6.00, מסנן Notch: 50.0 הרץ, מסנן הסרת ספייק: כבוי, סף אימות (cal. יחידה): 12.00, סף דחייה (cal. יחידה): 8.00, נגזרת בהתחלה upstroke (cal U/s): 10.00, מגבלות דחייה: כבוי, עיכוב מהפניה ecg: חלון מוגדר על-ידי המשתמש, עיכוב מינימלי מ-ecg Rpeak (ms): 10.00, עיכוב מרבי מ-ecg Rpeak (ms): 250.00, Conduct_time_1 מהסימן: לא מחושב, Conduct_time_2 מהסימן: לא מחושב, BR (קצב נשימה): כבוי, BRS (רגישות Baroreflex): מופעל, מספר פעימה רצופה מינימלית: 3, מספר פעימת חביון: 1, ערך לחץ: SBP, סימון לחישוב מרווח דופק: R, וריאציית לחץ מינימלית (caIU): 0.50, וריאציה מינימלית של מרווח (ms): 2.00, מתאם מינימלי: 0.75 סנן את אות הפעילות עבור רצף של 3 שעות עם פעילות נמוכה. בצע את ניתוח BRS בחלון זמן זה מכיוון שפעילות גבוהה של בעלי החיים מפריעה למתאם BP ו- RR. בצע ניתוח BP ו- RR במהלך חלון זמן זה של 3 שעות תוך חלוקת הניתוח של 3 שעות לשלבים של 10 דקות. בצע ניתוח BRS באמצעות רצף הפקודות הבא: פתח את חלון ניתוח BRS > הצג ניתוח > BRS. פעולה זו פותחת את לוח הניתוח של BRS. בדוק ידנית כל רצף המוצג בלוח ניתוח BRS ולא כולל פעימות חוץ רחמיות, הפסקות סינוסים, אירועים הפרעות קצב או נתונים רועשים. הקפד לפסול כל פעימה של רצפים כאלה כדי להוציא אותם בהצלחה מהניתוח. יצא את תוצאות ניתוח BRS לקובץ גיליון אלקטרוני (קובץ תוצאות). שנה את הפרמטרים המיוצאים לקובץ הגיליון האלקטרוני באמצעות רצף הפקודות הבא (קבצים משלימים 5-7):כוונן פרמטרים > ברשימה/לקובץ > מקטעים > txt (קובץ משלים 5). בחר את המקטע “פעימות” וכל מקטע אחר המכיל מידע מעניין למעט סעיף הפעימות שבוטל. כוונן > פרמטרים ברשימה/לקובץ > שלבים > txt (קובץ משלים 6). בחר ערכי צעדים לייצוא. כוונן > פרמטרים ברשימה/לקובץ > פעימות -> txt (קובץ משלים 7). ודא שמקטע הפעימות בקובץ מכיל לפחות את הנתונים הבאים עבור כל פעימה בודדת. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=מרווחי פעימות רצופים של הרצף), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR של הפעימה הבאה) לאחר מכן לחץ על קובץ > שמור קובץ תוצאות. מיין את הנתונים המיוצאים עבור רצפים למעלה ולמטה באמצעות פונקציית הסינון של Excel (קובץ משלים 8). חשב את מספר הרצפים, שיפוע BRS ממוצע, סטיית תקן ושגיאת תקן של שיפוע BRS עבור רצפים למעלה ולמטה בנפרד. כמו כן לחשב את הסכום הכולל של רצפים לכל 1000 פעימות.הערה: תבנית גיליון אלקטרוני (TemplateBRS) למיון וניתוח אוטומטיים של רצפים למעלה ולמטה מסופקת בתוספת (קובץ משלים 8) ומקלה על הניתוח. על-ידי התאמת פונקציית המסנן, ניתן למיין רצפים לפי מספרי פעימות שונים (לדוגמה, רצפים של שלוש או ארבע פעימות). לפרטים נוספים ראו קבצים משלימים 9-13.פתח את קובץ התוצאות ואת קובץ TemplateBRS Excel (קובץ משלים 8). העתק את הנתונים של העמודות הבאות מקובץ התוצאות: (לחץ)_BRS_deltaP, (לחץ)_BRS_# ו- (לחץ)_BRS_slope (קובץ משלים 9). הדבק את הנתונים בעמודות המתאימות של הגיליונות האלקטרוניים “רצפים למעלה” ו”רצפים למטה” בקובץ TemplateBRS (קובץ משלים 10). בנוסף, העתק את נתוני העמודה (לחץ)_BRS_SBP מקובץ התוצאות (קובץ משלים 11) והדבק אותם בגיליון האלקטרוני “כל הרצפים” בקובץ TemplateBRS (קובץ משלים 12).הערה: המספר בעמודה (לחץ)_BRS_# רשום רק בפעימה האחרונה של רצף ומתאר את אורך הרצף. ניתן להבחין בין רצפים למעלה ולמטה על ידי סימן הערך (לחץ)_deltaP. ערכים שליליים עבור הפעימה השנייה והשלישית של רצף של שלוש פעימות מצביעים על רצף למטה. ערכים חיוביים מציינים רצף כלפי מעלה, בהתאמה. סנן את הנתונים שהועתקו באמצעות הגדרות המסנן המוגדרות כברירת מחדל. לחץ על סמל המסנן של העמודה (לחץ)_BRS_# ולחץ על “אישור” (קובץ משלים 13). החל שלב זה על הגיליונות האלקטרוניים “רצפים למעלה” ו”רצפים למטה”.הערה: מסנני הגיליון האלקטרוני עבור רצפים של שלוש פעימות. אם נדרשים אורכי רצף אחרים, יש לשנות את ההגדרה של עמודה זו בתפריט הנפתח. חישובים עבור מספר הרצפים, שיפוע BRS ממוצע, סטיית תקן ושגיאת תקן של שיפוע BRS מוצגים בתיבות הירוקות של הגיליונות האלקטרוניים “רצפים למעלה” ו”רצפים למטה”. חישובים עבור המספר הכולל של רצפים לכל 1000 פעימות מופיעים בתיבה הירוקה של הגיליון האלקטרוני “כל הרצפים”.

Representative Results

תוצאות חיוביות עבור נתונים גולמיים של אק”ג ו-BPבאמצעות פרוטוקול זה ניתן לקבל נתוני אק”ג ו-BP באיכות גבוהה (איור 4 וקובץ משלים 14), המאפשרים לא רק ניתוח BRS מדויק אלא גם ניתוח של מגוון רחב של פרמטרים הנגזרים מאק”ג או BP, כגון מרווחי אק”ג (איור 4B, פאנל עליון), פרמטרים של לחץ דם (איור 4B, פאנל תחתון), קצב לב ושונות לחץ דם, גילוי הפרעות קצב וכו’12,13,14,15. איור 4: הקלטות טלמטריות של אק”ג ו-BP. (A) מעקב אק”ג מייצג ואיכותי (פאנל עליון) והקלטות BP גולמיות באיכות גבוהה תואמות (פאנל תחתון). (B) הגדלת עקבות אק”ג (פאנל עליון). גל P, קומפלקס QRS, גל T ומרווח RR מסומנים. הגדלת נתוני BP המתאימים (לוח תחתון). BP דיאסטולי (DBP) ו- BP סיסטולי (SBP) מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. תוצאות חיוביות עבור שעון ביולוגיעכבר בריא שהתאושש מספיק מניתוח מראה עלייה פיזיולוגית של פעילות, HR ו-BP במהלך שלב הפעילות (החשוך) (איור 5). גורמים רבים ושונים יכולים להפריע לשעון הביולוגי הרגיל הזה. אלה כוללים מתח פסיכולוגי, רעש אקוסטי או חשמלי וכאב. לדוגמה, מצב כאב חריף מיד לאחר הניתוח יגרום לעלייה בקצב הלב עם ירידה בו זמנית בפעילות. לכן, השעון הביולוגי הוא אינדיקטור חשוב לבריאות ורווחת בעלי החיים ויש לבדוק אותו באופן שגרתי לפני ניתוח BRS. איור 5: ניתוח מדידות טלמטריה ארוכות טווח לקביעת שינויים בשעון הביולוגי . השעון הביולוגי של קצב הלב (A), הפעילות (B), לחץ הדם הסיסטולי (C) ולחץ הדם הדיאסטולי (D) היה ממוצע של 9 עכברי בר זכרים מסוג C57BL/6J במהלך 12 שעות של מחזורי אור וחושך. אזורים אפורים מתארים את שלב הפעילות (כהה) ואזורים לבנים מתארים את שלב המנוחה (הבהיר) של בעלי החיים. כל הפרמטרים מורמים פיזיולוגית בשלב הפעילות (החשוך) של החיה. הנתונים מיוצגים כממוצע +/- SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. תוצאות חיוביות לניתוח BRSלאחר ביצוע הניתוח כמתואר בסעיף 2.8 של הפרוטוקול, התוכנה תזהה רצפים למעלה ולמטה, בהתאמה. השיטה שבה משתמשים נקראת שיטת רצף מאחר ששינויים במרווחי SBP ו-RR נבחנים על בסיס פעימה לפעימה במהלך רצפים קצרים של שלוש פעימות או יותר עם עלייה או ירידה ספונטנית ב-SBP (איור 6). עלייה מתמשכת ב-SBP על פני שלוש פעימות לב גורמת לעלייה רפלקסיבית בפעילות הפאראסימפתטית וכתוצאה מכך מאטה את הדופק, המקביל למרווחי RR ארוכים יותר. ההשהיה להסתגלות רפלקס HR היא פעימה אחת. רצף כזה מוצג באיור 6A ומוגדר כרצף מעלה. לעומת זאת, ירידה מתמשכת ב-SBP במשך שלוש פעימות עם עלייה מקבילה ב-HR (ירידה במרווח RR) מוגדרת כרצף מטה (איור 6B). כדי להעריך את המתאם בין RR ו-SBP, שני הפרמטרים משורטטים זה כנגד זה והשיפוע (ms/mmHg) של קו הרגרסיה הליניארית מחושב עבור כל רצף (איור 6A,B, לוחות נמוכים יותר). לאחר מיון לפי רצפים למעלה ולמטה, ניתן לחשב את מספר הרצפים הממוצע לכל 1000 פעימות (איור 6C) ואת הרווח הממוצע של BRS ספונטני עבור רצפים למעלה ולמטה, בהתאמה (איור 6D,E). הרווח של BRS ספונטני משתקף על ידי שיפוע קו הרגרסיה הליניארית המחושב מיחס RR/SBP. לסטייה מערכי BRS נורמליים יכולות להיות סיבות שונות. אלה כוללים שינויים בקלט ANS או שינויים בהיענות של הצומת הסינואפרוזדורי לקלט מערכת העצבים האוטונומית. באיור 6 BRS מוגבר במודל עכבר לתסמונת סינוס חולה (SSS) עם היענות מוגזמת של הצומת הסינואפרוזדורי לקלט ואגאלי מוצג11. איור 6: הערכת BRS בשיטת הרצף. (A) עקבות BP מייצגות של עכבר C57BL/6J מסוג פראי במהלך רצף למעלה של שלוש פעימות רצופות (פאנל עליון) הקשורות לעלייה מקבילה במרווח RR (פאנל אמצעי) המקבילה לירידה ב- HR. מרווחי RR שורטטו כנגד SBP (לוח תחתון). שיפוע קו הרגרסיה (הקו האדום) עבור הרצף למעלה המתואר בלוח העליון והאמצעי (WT, עיגולים שחורים) היה 4.10 ms/mmHg. קשר RR/SBP מייצג של מודל עכבר תסמונת סינוס חולה הניב שיפוע מוגבר של 6.49 ms/mmHg המציין BRS גבוה (SSS, עיגולים אפורים). (B) רצף מטה מייצג של עכבר מסוג Wild עם ירידה ב-SBP (פאנל עליון) וירידה לאחר מכן במרווח RR (פאנל אמצעי) שתוצאתו שיפוע BRS של 4.51ms/mmHg (פאנל תחתון; WT, עיגולים שחורים). יחס RR/SBP מייצג של מודל עכבר תסמונת סינוס חולה (SSS, עיגולים אפורים) עם שיפוע של 7.10 ms/mmHg. כיוון ראשי החצים האדומים מציין את כיוון הרצפים (רצף למעלה או למטה). (C) כמות כוללת של רצפים לכל 1000 פעימות עבור עכברי WT ו-SSS. (D) שיפוע ממוצע של הקשר RR/SBP עבור רצפי מעלה עבור עכברי WT ו-SSS. (E) שיפוע ממוצע של יחס RR/SBP עבור רצפים למטה עבור עכברי WT ו-SSS. הנתונים הסטטיסטיים ב- (C-E) בוצעו מתוצאות של שישה חיות WT זכרים ושמונה חיות זכרים של מודל עכבר תסמונת סינוס חולה. תיבות מציגות את הקו החציוני, perc 25/75 וערך מינימום/מקסימום; סמלים פתוחים מייצגים את הערך הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. תוצאה שלילית עבור איכות הנתונים הגולמייםבמיוחד בשלבים של פעילות גבוהה יותר, איכות האות עשויה לרדת (איור 7 וקבצים משלימים 15,16). זה יכול להיגרם על ידי תזוזה זמנית או מיקום שגוי של קטטר BP או מוליכי אק”ג או שניהם עקב תנועה של החיה. כמו כן, פעילות שרירי השלד עשויה להיות מזוהה מהמוליכים של האק”ג ולגרום לרעש (איור 7B, פאנל עליון). עם הגדרות התוכנה המתוארות לעיל, פעימות באיכות נמוכה אלה אינן מזוהות ולכן אינן נכללות בניתוח. עם זאת, בדיקה ידנית של הנתונים הגולמיים המנותחים היא חובה. איור 7: דוגמאות לאותות גולמיים באיכות נמוכה. (A) אות אק”ג (פאנל עליון) מזוהה באיכות טובה, אך איכות אות BP (לוח תחתון) נמוכה. (B) איכויות של אות אק”ג (פאנל עליון) ואות BP (פאנל תחתון) אינן מספיקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. תוצאות שליליות לניתוח BRSהגדרות ניתוח BRS המפורטות בסעיף פרוטוקול 2.8.3 חיוניות באופן כללי לזיהוי מהיר ונכון של רצפים למעלה ולמטה. מקדם המתאם המינימלי לקו הרגרסיה מוגדר ל-0.75. קביעת ערכים נמוכים מדי עבור מקדם המתאם המינימלי גורמת לזיהוי שגוי של רצפים שאינם משקפים פעילות baroreflex אלא נובעים מפעימות הפרעות קצב (איור 8). לניתוח BRS יש לנתח רק אפיזודות עם קצב סינוס יציב. פעימות חוץ רחמיות או אירועים אריתמיים אחרים, כגון הפסקות סינוסים, ניתן למצוא עם אפשרות HRV של תוכנות ניתוח ECG ו- BP ויש לפסול אותם. איור 8: רצפים שאינם משקפים פעילות baroreflex . (A) עקבות אק”ג של עכבר עם הפרעות קצב קלות בסינוסים. (B) הקלטת BP המתארת עלייה ספונטנית ב-SBP. (C) מרווחי RR תואמים מצביעים על ירידה של HR עם הגידול של BP. (D) חלקה של SBP ומרווחי RR תואמים. מקדם המתאם הנמוך של קו הרגרסיה מצביע על כך שהפחתת משאבי אנוש לא נגרמה על ידי פעילות של הברופלקס אלא על ידי הפרעות קצב בסינוסים. (E) עקבות אק”ג גולמיים המתארים הפסקת סינוס. (F) אות BP גולמי תואם. הפסקת הסינוס גורמת לירידה בלחץ הדם הדיאסטולי. לחץ הדם הסיסטולי של הפעימה הבאה כמעט ולא מושפע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. קובץ משלים 1: פרוטוקול ניתוח. תבנית לתיעוד ההליך הכירורגי והטיפול שלאחר הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 2: המרת נתוני Dataquest A.R.T לנתוני IOX לניתוח בתוכנת ecgAUTO. בחר בעלי חיים ברשימת הנושאים (משמאל) ולחץ ואק”ג ברשימת צורות הגל (מימין). לחץ על אישור כדי להמיר נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 3: הגדרות אק”ג לניתוח BRS. הגדר פרמטרים כמפורט, לחץ על אישור והחל את התצורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 4: הגדרות BP עבור ניתוח BRS. הגדר פרמטרים כמפורט, לחץ על אישור והחל את התצורה. שמור את התצורה כקובץ תצורה כדי שתוכל לטעון את ההגדרות בקלות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 5: פרמטרים בחלון רשימה/לקובץ עבור “סעיפים”. בחר מקטעים לייצוא תחת המקטעים > txt header (נבחר) ולחץ על Apply!. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 6: פרמטרים בחלון רשימה/לקובץ עבור “שלבים”. בחר נתוני צעד לייצוא תחת השלבים > כותרת txt (נבחרת) והקש Apply!. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 7: פרמטרים בחלון רשימה/לקובץ עבור “פעימות”. בחר ערכים לייצוא תחת הכותרת beats > txt (נבחרה) ולחץ על Apply!. עבור ניתוח BRS הפרמטרים מתוקתקים נחוצים. שים לב לסדר הבחירה המצוין על ידי המספרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 8: קובץ גיליון אלקטרוני TemplateBRS. תבנית גיליון אלקטרוני למיון וניתוח אוטומטיים של רצפים למעלה ולמטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 9: העתקת נתונים רלוונטיים מקובץ התוצאות I. העתק את העמודות (לחץ)_BRS_deltaP, (לחץ)_BRS_# ו- (לחץ)_BRS_slope מקובץ התוצאות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 10: קובץ תבנית גיליון אלקטרוני (TemplateBRS) למיון וניתוח נתונים I. הדבק את הנתונים המועתקים בעמודות המתאימות של הגיליון האלקטרוני “רצפים למעלה” ו”רצפים למטה” בקובץ הגיליון האלקטרוני של TemplateBRS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 11: העתקת נתונים רלוונטיים מקובץ התוצאות II. העתק את העמודה (לחץ)_BRS_SBP מקובץ התוצאות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 12: קובץ תבנית גיליון אלקטרוני (TemplateBRS) למיון וניתוח נתונים II. הדבק את נתוני SBP המועתקים בגיליון האלקטרוני “כל הרצפים” בקובץ הגיליון האלקטרוני TemplateBRS כדי לחשב את המספר הכולל של הרצפים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 13: סינון וניתוח הרצפים. בגיליון האלקטרוני “למעלה רצפים” של קובץ הגיליון האלקטרוני TemplateBRS, פתח את התפריט הנפתח של מסנן העמודות (לחץ)_BRS_# ולחץ על אישור מבלי לשנות פרמטרים. פעולה זו תמיין באופן אוטומטי את הנתונים ותעדכן את החישובים עבור רצפים עם 3 פעימות. חזור על פעולה זו עבור הגיליון האלקטרוני “רצפים למטה”. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 14: צילום מסך של הקלטה באיכות גבוהה שזוהתה באמצעות תוכנת ניתוח אק”ג ו-BP. העקבה העליונה (ECG) מראה זיהוי של כל פסגת R והעקבה התחתונה (BP) מראה זיהוי של כל שיא לחץ דיאסטולי (DP) ולחץ סיסטולי (SP). אזורים מתחת לפסגות שזוהו בהצלחה מסומנים באדום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 15: צילום מסך של הקלטת BP באיכות נמוכה שבה פרמטרים של BP מזוהים באופן חלקי בלבד. העקבה העליונה (ECG) מציגה זיהוי של כל פסגת R, אך העקבה התחתונה (BP) מציגה רווחים בין פסגות BP שזוהו. שיאים שזוהו של לחץ דיאסטולי (DP) ולחץ סיסטולי (SP) מסומנים באזורים אדומים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 16: צילום מסך של הקלטת אק”ג ו-BP באיכות נמוכה שבה לא היתה אפשרות לזהות פרמטרים של אק”ג ו-BP. המעקב העליון (ECG) מציג אזור (רקע סגול) שבו לא היתה אפשרות לזהות פרמטרים של אק”ג. זיהוי BP (מעקב נמוך יותר) נכשל גם הוא עקב איכות אות נמוכה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

משמעות השיטה ביחס לשיטות חלופיות
בעבודה הנוכחית אנו מציגים פרוטוקול מפורט לכימות BRS ספונטני בשיטת הרצף. גישה זו משתמשת בשינויים ספונטניים של BP ורפלקס HR הנמדדים באמצעות טלמטריה של אק”ג ו-BP. היתרון בשיטה זו הוא שניתן לרשום את שני הפרמטרים בבעלי חיים מודעים, נעים בחופשיות וללא מעצורים מבלי להפריע לבעלי חיים על ידי כניסה לחדר בו מבוצעות המדידות או אפילו על ידי אינטראקציה פיזית הנדרשת להזרקת סמים. נקודה זו חשובה מאוד מכיוון שהוכח בבירור כי הפרעות כאלה מפריעות באופן חמור להקלטות משאבי אנוש ו- BP. לדוגמה, הזרקת תרופות דורשת קיבוע של העכברים, מה שגורם לתגובת לחץ מקסימלית המגבירה את HR עד 650-700 פעימות לדקה. כדי לעקוף את תגובות הלחץ הללו, BRS נקבע בעבר בעכברים מורדמים. עם זאת, חומרי הרדמה סטנדרטיים המשמשים ברפואה וטרינרית כגון קטמין/קסילזין או איזופלורן גורמים לברדיקרדיה ומשפיעים על תגובות רפלקס אוטונומיות, ומגבילים את תוקפן של גישות אלה ואת פרשנות התוצאות. כדי להתגבר חלקית על מגבלות אלה נעשה שימוש במכשירים מושתלים להעברת תרופות, כלומר משאבות אוסמוטיות, שיכולות לשחרר תרופות לחלל הצפק. עם זאת, עם משאבות אוסמוטיות לא ניתן להחיל בולוס של מינון מוגדר של תרופה המגבילה את היישום של מכשירים כאלה. לחלופין, צנתרי עירוי מורכבים¹⁷ ניתן להשתיל בעכברים על מנת לתת תרופות. עם זאת, צנתרים אלה קשים לטיפול ודורשים מיומנויות כירורגיות דומות לאלה הנדרשות להשתלת מכשירים טלמטריים, תוך הפקת תוצאות מדעיות פחותות בהשוואה למדידות של BRS ספונטני. לצד הבעיות הטכניות הקשורות למדידת BRS באמצעות הזרקת תרופות, ישנן כמה מגבלות הקשורות לפעולת התרופה כשלעצמה. גישות מסורתיות לקביעת BRS כוללות זריקות בולוס של תרופות vasoactive. עם זאת, הזרקת בולוס של מכווצי כלי דם (למשל, פנילפרין) או מרחיבי כלי דם (למשל, נתרן nitroprusside) נחשבו גירוי מוגזם ולא פיזיולוגי להסתגלות רפלקס HR לשינויים BP¹⁸. ניתן לכמת את הפעילות הספונטנית של רפלקס הברצפטור גם באמצעות שיטות ספקטרליות. אחת השיטות הללו מעריכה BRS בתחום התדרים על ידי חישוב היחס בין שינויים בדופק לשינויים בלחץ הדם בתחום תדרים מסוים¹⁸^,¹⁹. שיטות ספקטרליות אחרות כרוכות בקביעת פונקציית ההעברה של BP ו- HR או בכימות הקוהרנטיות בין BP ל- HR²⁰^,²¹. שיטות אלה דורשות גם רכישה טלמטרית של פרמטרים ספונטניים של BP ו- HR ובעוד שהן מתאימות לקביעת BRS ספונטני, הן דורשות כלים חישוביים אינטנסיביים ומאתגרות ליישום. יתר על כן, כל השיטות הספקטרליות סובלות מהמגבלה שאותות לא נייחים מונעים יישום של שיטות ספקטרליות. בפרט, שיאים ספקטרליים הנגרמים על ידי מקצבי נשימה יכולים להיות מופחתים בחולים אנושיים על ידי בקשה מהמטופל להפסיק לנשום, בעוד שזה כמובן לא אפשרי בעכברים. לכן, יחס האות לרעש הוא לעתים קרובות נמוך למדי בעכברים. בהתחשב במגבלות השיטות שנדונו לעיל, אנו מעדיפים את שיטת הרצף לקביעת BRS בעכברים. יתרון ניכר של שיטה זו הוא העובדה שמדובר בטכניקה לא פולשנית המספקת נתונים על BRS ספונטני בתנאי אמת²². נקודה חשובה נוספת היא שמשך הרצפים המנותחים בשיטת הרצף קצר למדי, וכולל 3-5 פעימות. ויסות רפלקס של HR על ידי עצב vagal הוא מהיר מאוד היטב בתוך מסגרת הזמן של רצפים אלה. לכן, שיטת הרצף מתאימה היטב להעריך את תרומתו של העצב הווגאלי ל- BRS. לעומת זאת, הוויסות של מערכת העצבים הסימפתטית איטי בהרבה. למעשה, במהלך רצפים קצרים אלה ניתן להניח שהפעילות של מערכת העצבים הסימפתטית היא כמעט קבועה. לכן, השיטה מותאמת אישית כדי לזהות באופן סלקטיבי שינויים רפלקס של HR מונע על ידי פעילות עצב התועה.

פרשנות נתוני BRS
לצורך פענוח של תפקוד לקוי של BRS או נתוני BRS כשלעצמם, חשוב לקחת בחשבון את הרמות התפקודיות האינדיבידואליות המעורבות ברפלקס הברצפטור. ברמה העצבית, מרכיבים רגשיים, מרכזיים או תוססים של הרפלקס עשויים להיות מושפעים²³. ברמה הקרדיווסקולרית, היענות מופחתת או מוגזמת של הצומת הסינואפרוזדורי לקלט ANS עשויה להיות נוכחת^11,24. שינוי בכל רמה יכול להוביל לשינויים ב- BRS. על מנת לנתח האם מנגנונים עצביים ו / או לבביים אחראים לשינויים שנצפו ב- BRS, ניתן להשתמש בגישות למחיקת גנים ספציפיים ללב או נוירון, הפלות או עריכת גנים.

שלבים קריטיים בפרוטוקול
השלב המתוחכם והקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא הכנה וקנולציה של עורק התרדמה השמאלי (שלב 2.3). המתח של תפר החסימה הקאודלי צריך להיות גבוה מספיק כדי לעצור לחלוטין את זרימת הדם לפני קנולציה. אחרת, אפילו דליפה קטנה של דם במהלך קנולציה יכולה להגביל מאוד את הראות או אפילו לגרום לעכבר לדמם למוות. קנולציה צריכה להיות מוצלחת בניסיון הראשון. עם זאת, עם כישלון הניסיון הראשון, עדיין ניתן לנסות בזהירות קנולציה.

חתך קו האמצע והתעלה התת עורית מהצוואר לאגף השמאלי (שלב 2.3) חייבים להיות גדולים מספיק כדי להכניס את המשדר בקלות ללא כוח, אך חייבים גם להיות קטנים ככל האפשר כדי לשמור על המשדר במקומו. אחרת, יהיה צורך לנעול אותו למקומו עם חומר תפר או דבק רקמות. מאז עכברים יש עור עדין מאוד, נמק של העור יכול להתרחש אם המנהרה עבור המשדר הוא קטן מדי.

אם אלקטרודות האק”ג ארוכות מכדי להיכנס לתעלה התת עורית (שלב 2.4), יש צורך ליצור קצה חדש על ידי קיצור האלקטרודה לאורך מתאים. האלקטרודה חייבת לשכב שטוחה כנגד הגוף לכל אורך העופרת. אלקטרודות ארוכות מדי יפריעו לבעלי החיים והם ינסו לפתוח את הפצע כדי להסיר את המשדר, וכתוצאה מכך סיכון לגירוי רקמות ולחישה של הפצע. מוליכים קצרים מדי ניתנים כמובן להארכה וייתכן שבמקרה זה לא ניתן למקם את האלקטרודות באופן כזה שהן מתאימות לתצורת איינתובן II. לכן אנו ממליצים לקבוע את האורך האופטימלי של מוליכי האק”ג על עכבר מת מאותו מין, משקל ורקע גנטי.

יש לתת לעכברים זמן החלמה ארוך יותר לאחר השתלת המשדר אם אין להם שעון ביולוגי תקין וזה לא הפנוטיפ של קו העכבר הנחקר (שלב 2.7). סיבה נוספת להפרעות בשעון הביולוגי יכולה להיות בידוד אקוסטי לקוי של מתקן בעלי החיים או אנשי הצוות הנכנסים לחדר במהלך המדידה.

ניתוח נתוני ECG, BP ו- BRS הוא ישר קדימה (שלב 2.8). הצעד הקריטי ביותר הוא להוציא פעימות חוץ רחמיות, הפסקות סינוסים, פרקים הפרעות קצב או קטעים עם אותות באיכות נמוכה מניתוח נתונים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית [FE 1929/1-1 ו- WA 2597/3-1]. אנו מודים לסנדרה דירשל על הסיוע הטכני המצוין ולג’וליה רילינג על הייעוץ הווטרינרי.

Materials

Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL	CP-Pharma, Germany	1229	anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe	Wolfram Droh GmbH, Germany	9166017V
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer AG, Germany
Blunt dissecting scissors	Fine Science Tools GmbH, Germany	14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL	CP-Pharma, Germany	115	preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectant	BODE Chemie GmbH, Germany	9803650
Cotton Tipped Applicator sterile	Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany	09-119-9100
Forceps – Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools GmbH, Germany	11253-25
Forceps – straight	Fine Science Tools GmbH, Germany	11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton	Paul Hartmann AG. Germany	401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters	Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probe	Harvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools GmbH, Germany	18000-45
Ketamine 10%	Ecuphar GmbH, Germany	799-760	anesthesia
Magnet	Data Sciences International, United States		transmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter	Fine Science Tools GmbH, Germany	12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710005525	24 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710004020	27 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)	Resorba Medical, Germany	PA10273	lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)	Resorba Medical, Germany	4023	skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope	Zeiss, Germany
Pilca depilatory mousse	Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany	6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%	Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solution	B. Braun Melsungen AG, Germany	401-951
Sensitive plasters, Leukosilk	BSN medical GmbH, Germany	102100	surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesive	SMI, Belgium	ZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)	Resorba Medical, Germany	G2105	lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1	Procter & Gamble
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools GmbH, Germany	18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%	Ecuphar GmbH, Germany	797469	anesthesia
Data acquisition and analysis	Source
DSI Data Exchange Matrix	Data Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI Ponemah	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for mice	Data Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1	Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11	EMKA Technologies		ECG and BP analysis software
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, United States

References

Landgren, S. On the excitation mechanism of the carotid baroceptors. Acta Physiologica Scandinavica. 26 (1), 1-34 (1952).
Heyman, C., Neil, E. Reflexogenic areas of the cardiovascular system. British Journal of Surgery. 46 (195), 92 (1958).
Lu, Y., et al. The ion channel ASIC2 is required for baroreceptor and autonomic control of the circulation. Neuron. 64 (6), 885-897 (2009).
Fadel, P. J., Raven, P. B. Human investigations into the arterial and cardiopulmonary baroreflexes during exercise. Experimental Physiology. 97 (1), 39-50 (2012).
Nagura, S., Sakagami, T., Kakiichi, A., Yoshimoto, M., Miki, K. Acute shifts in baroreflex control of renal sympathetic nerve activity induced by REM sleep and grooming in rats. The Journal of Physiology. 558, 975-983 (2004).
Crandall, C. G., Cui, J., Wilson, T. E. Effects of heat stress on baroreflex function in humans. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (3), 321-328 (2003).
Crandall, M. E., Heesch, C. M. Baroreflex control of sympathetic outflow in pregnant rats: effects of captopril. The American Journal of Physiology. 258 (6), 1417-1423 (1990).
Mortara, A., et al. Arterial baroreflex modulation of heart rate in chronic heart failure: clinical and hemodynamic correlates and prognostic implications. Circulation. 96 (10), 3450-3458 (1997).
La Rovere, M. T., Bigger, J. T., Marcus, F. I., Mortara, A., Schwartz, P. J. Baroreflex sensitivity and heart-rate variability in prediction of total cardiac mortality after myocardial infarction. ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) Investigators. Lancet. 351 (9101), 478-484 (1998).
Robinson, T. G., Dawson, S. L., Eames, P. J., Panerai, R. B., Potter, J. F. Cardiac baroreceptor sensitivity predicts long-term outcome after acute ischemic stroke. Stroke. 34 (3), 705-712 (2003).
Fenske, S., et al. cAMP-dependent regulation of HCN4 controls the tonic entrainment process in sinoatrial node pacemaker cells. Nature Communications. 11 (1), 5555 (2020).
Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
Thireau, J., Zhang, B. L., Poisson, D., Babuty, D. Heart rate variability in mice: a theoretical and practical guide. Experimental Physiology. 93 (1), 83-94 (2008).
Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory Mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260 (2011).
Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
Optical and electrophysiological approaches to examine the role of cAMP-dependent regulation of the sinoatrial pacemaker channel HCN4. Dissertation, LMU Munich Available from: https://edoc.ub.uni-muenchen.de/24431/1/Brox_Verena.pdf (2019)
Just, A., Faulhaber, J., Ehmke, H. Autonomic cardiovascular control in conscious mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (6), 2214-2221 (2000).
Parati, G., Di Rienzo, M., Mancia, G. How to measure baroreflex sensitivity: from the cardiovascular laboratory to daily life. Journal of Hypertension. 18 (1), 7-19 (2000).
Robbe, H. W., et al. Assessment of baroreceptor reflex sensitivity by means of spectral analysis. Hypertension. 10 (5), 538-543 (1987).
Pinna, G. D., Maestri, R., Raczak, G., La Rovere, M. T. Measuring baroreflex sensitivity from the gain function between arterial pressure and heart period. Clinical Science. 103 (1), 81-88 (2002).
Pinna, G. D., Maestri, R. New criteria for estimating baroreflex sensitivity using the transfer function method. Medical and Biological Engineering and Computing. 40 (1), 79-84 (2002).
Laude, D., Baudrie, V., Elghozi, J. L. Applicability of recent methods used to estimate spontaneous baroreflex sensitivity to resting mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 294 (1), 142-150 (2008).
Ma, X., Abboud, F. M., Chapleau, M. W. Analysis of afferent, central, and efferent components of the baroreceptor reflex in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 283 (5), 1033-1040 (2002).
Fleming, S., et al. Impaired Baroreflex Function in Mice Overexpressing Alpha-Synuclein. Frontiers in Neurology. 4 (103), (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Rötzer, R. D., Brox, V. F., Hennis, K., Thalhammer, S. B., Biel, M., Wahl-Schott, C., Fenske, S. Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (168), e62101, doi:10.3791/62101 (2021).

Automatically Generated