Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Ren&#233; D. R&#246;tzer; Verena F. Brox; Konstantin Hennis; Stefan B. Thalhammer; Martin Biel; Christian Wahl-Schott; Stefanie Fenske

doi:10.3791/62101

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Medicine

Implantation von kombinierten telemetrischen EKG- und Blutdrucktransmittern zur Bestimmung der spontanen Baroreflexsensitivität bei bewussten Mäusen

Published: February 14, 2021

doi:

10.3791/62101

René D. Rötzer¹, Verena F. Brox¹, Konstantin Hennis¹, Stefan B. Thalhammer¹, Martin Biel^1,2, Christian Wahl-Schott³, Stefanie Fenske^1,2

¹Center for Integrated Protein Science (CIPS-M) and Center for Drug Research, Department of Pharmacy,Ludwig-Maximilians-Universität München, ²German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance, ³Hannover Medical School,Institute for Neurophysiology

Summary

Der Baroreflex ist ein Mechanismus zur Regulierung der Herzfrequenz durch das autonome Nervensystem als Reaktion auf Blutdruckänderungen. Wir beschreiben eine Operationstechnik zur Implantation von Telemetriesendern zur kontinuierlichen und simultanen Messung von Elektrokardiogramm und Blutdruck bei Mäusen. Dadurch kann die spontane Baroreflexsensitivität bestimmt werden, ein wichtiger prognostischer Marker für Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Abstract

Blutdruck (BP) und Herzfrequenz (HR) werden beide vom autonomen Nervensystem (ANS) gesteuert und sind durch Reflexmechanismen eng miteinander verflochten. Der Baroreflex ist ein wichtiger homöostatischer Mechanismus, um akuten, kurzfristigen Veränderungen des arteriellen Blutdrucks entgegenzuwirken und den Blutdruck in einem relativ engen physiologischen Bereich zu halten. Der Blutdruck wird von Barorezeptoren wahrgenommen, die sich im Aortenbogen und im Sinus carotis befinden. Wenn sich der Blutdruck ändert, werden Signale an das zentrale Nervensystem weitergeleitet und dann an die parasympathischen und sympathischen Zweige des vegetativen Nervensystems weitergeleitet, um die Herzfrequenz anzupassen. Ein Anstieg des Blutdrucks führt zu einer reflexartigen Abnahme der Herzfrequenz, ein Abfall des Blutdrucks führt zu einer reflexartigen Erhöhung der Herzfrequenz.

Die Baroreflex-Sensitivität (BRS) ist der quantitative Zusammenhang zwischen Veränderungen des arteriellen Blutdrucks und entsprechenden Veränderungen der Herzfrequenz. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind häufig mit einer Beeinträchtigung der Baroreflexfunktion verbunden. In verschiedenen Studien wurde über eine reduzierte BRS berichtet, z. B. bei Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt oder koronarer Herzkrankheit.

Die Bestimmung des BRS erfordert Informationen sowohl von BP als auch von HR, die gleichzeitig mit telemetrischen Geräten aufgezeichnet werden können. Der chirurgische Eingriff wird beschrieben, beginnend mit dem Einführen des Drucksensors in die linke Halsschlagader und der Positionierung seiner Spitze im Aortenbogen zur Überwachung des arteriellen Drucks, gefolgt von der subkutanen Platzierung des Transmitters und der EKG-Elektroden. Wir beschreiben auch die postoperative Intensivmedizin und das analgetische Management. Nach einer zweiwöchigen postoperativen Genesungsphase werden Langzeit-EKG- und Blutdruckmessungen bei bewussten und ungezügelten Mäusen durchgeführt. Abschließend werden Beispiele für qualitativ hochwertige Aufnahmen und die Analyse der spontanen Barorezeptorsensitivität mit der Sequenzmethode vorgestellt.

Introduction

Der arterielle Barorezeptorreflex ist das wichtigste Rückkopplungskontrollsystem beim Menschen, das eine kurzzeitige – und möglicherweise auch^{längerfristige} ^1,2 – Kontrolle des arteriellen Blutdrucks (ABP) ermöglicht. Dieser Reflex puffert Störungen im Blutdruck ab, die als Reaktion auf physiologische oder umweltbedingte Auslöser auftreten. Es bietet sofortige Reflexänderungen der Herzfrequenz, des Schlagvolumens und des gesamten peripheren arteriellen Widerstands. Der Reflex hat seinen Ursprung in sensorischen Nervenenden im Aortenbogen und in den Halsschlagadern. Diese Nervenendigungen bilden die arteriellen Barorezeptoren. Die Spaltöffnungen der Nervenendigungen im Aortenbogen befinden sich im Ganglion nodose, während die der Nervenendigungen im Sinus carotis im Ganglion petrosus liegen. Der Reflex wird durch einen Anstieg des Blutdrucks ausgelöst, der die Barorezeptor-Nervenendigungen dehnt und aktiviert (Abbildung 1A). Die Aktivierung führt zu Aktionspotentialsalven, die zentral über den afferenten Aortendedrücker und den Sinus carotis an kardiovaskuläre Hirnstammkerne wie den Nucleus tractus solitarii und den Nucleus dorsalis des Vagusnervs weitergeleitet werden. Veränderungen in der afferenten Nervenaktivität modulieren wiederum die autonome efferente Aktivität. Eine erhöhte Aktivität der Barorezeptornerven verringert den Sympathikus und erhöht die Aktivität des Parasympathikus. Die Folgen der Aktivierung von Barorezeptoren sind also eine Verringerung der Herzfrequenz, des Herzzeitvolumens und des Gefäßwiderstands, die zusammen dem Blutdruckanstieg entgegenwirken und ihn abpuffern³. Im Gegensatz dazu erhöht eine verminderte Aktivität der Barorezeptornerven die Aktivität des Sympathikus und verringert die Aktivität des parasympathischen Nervs, was die Herzfrequenz, das Herzzeitvolumen und den Gefäßwiderstand erhöht und so dem Blutdruckabfall entgegenwirkt.

Zahlreiche Studien an Mensch und Tier haben gezeigt, dass der Barorezeptorreflex unter physiologischen Bedingungen wie Bewegung⁴, Schlaf⁵, Hitzestress⁶ oder Schwangerschaft⁷ eingestellt werden kann. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass der Baroreflex bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt und Schlaganfall chronisch beeinträchtigt ist. Tatsächlich wird die Baroreflexdysfunktion auch als prognostischer Marker bei verschiedenen Herz-Kreislauf-Erkrankungen verwendet ^8,9,10. Darüber hinaus ist eine Dysfunktion des Baroreflexes auch bei Erkrankungen des ANS vorhanden. Angesichts der Bedeutung des Barorezeptorreflexes für Gesundheit und Krankheitszustände ist die In-vivo-Abschätzung dieses Reflexes ein wichtiger Bestandteil der autonomen und kardiovaskulären Forschung mit schwerwiegenden klinischen Implikationen.

Genetische Mauslinien sind unverzichtbare Werkzeuge in der kardiovaskulären Forschung. In-vivo-Studien solcher Mauslinien liefern wertvolle Einblicke in die kardiovaskuläre Physiologie und Pathophysiologie und dienen in vielen Fällen als präklinische Modellsysteme für kardiovaskuläre Erkrankungen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die telemetrische in vivo EKG- und Blutdruckaufzeichnung bei bewussten, uneingeschränkten, sich frei bewegenden Mäusen vor und beschreiben, wie aus diesen Aufzeichnungen die Baroreflexsensitivität mit Hilfe der Sequenzmethode bestimmt werden kann (Abbildung 1B). Die angewandte Methode wird als Sequenzmethode bezeichnet, da die Schlag-zu-Schlag-Reihe von systolischen BP (SBP)- und RR-Intervallen auf kurze Sequenzen von drei oder mehr Schlägen während eines spontanen Anstiegs oder Abfalls des SBP mit Reflexadaption der HR untersucht wird. Diese Methode ist der Goldstandard für die Bestimmung der Baroreflexsensitivität, da nur spontane Reflexmechanismen untersucht werden. Die Technik ist älteren Techniken überlegen, die invasive Verfahren wie die Injektion von vasoaktiven Medikamenten beinhalteten, um Blutdruckveränderungen zu induzieren.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Baroreflexes und der Baroreflexsensitivitätsbeurteilung mit der Sequenzmethode. (A) Verlauf des Baroreflexes bei akutem Blutdruckanstieg. Ein kurzfristiger Anstieg des ABP wird von Barorezeptoren im Aortenbogen und im Karotissinus wahrgenommen. Diese Information wird an das zentrale Nervensystem weitergeleitet und induziert eine Abnahme der sympathischen Nervenaktivität bei gleichzeitiger Zunahme der parasympathischen Aktivität. Die Freisetzung von Acetylcholin aus Nervenendigungen, die sich in der Region des Sinusknotens befinden, induziert eine Abnahme des zweiten Botenstoffs cAMP in den Schrittmacherzellen des Sinusknotens und damit eine Verringerung der Herzfrequenz. Eine kurzfristige Senkung des Blutdrucks hat den gegenteiligen Effekt. (B) Schematische BP-Kurven während einer Aufwärtssequenz (oberes linkes Feld) und einer Abwärtssequenz (oberes rechtes Feld) von drei aufeinanderfolgenden Schlägen. Eine Aufwärtssequenz ist mit einer parallelen Zunahme der RR-Intervalle verbunden (unteres linkes Feld), was einer Abnahme der Herzfrequenz entspricht. Eine Abwärtssequenz ist mit einer parallelen Abnahme der RR-Intervalle (unteres rechtes Feld) verbunden, was einer Erhöhung der Herzfrequenz entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

Führen Sie alle Tierversuche in Übereinstimmung mit den lokalen institutionellen Richtlinien und den nationalen Gesetzen zu Tierversuchen durch. Für diesen Versuch wurden die Untersuchungen von der Regierung von Oberbayern genehmigt und entsprachen den deutschen Tierversuchsgesetzen. WT-Tiere (C57BL/6J-Hintergrund) und Tiere eines Sick-Sinus-Syndrom-Mausmodells mit erhöhter BRS-Sensitivität (Hcn4tm3(Y527F; R669E; T670A)Biel)11 (gemischter C57BL/6N- und 129/SvJ-Hintergrund) wurden für diese Studie verwendet. 1. Einrichten der Ausrüstung Nehmen Sie einen Telemetriesender aus der sterilen Verpackung und kürzen Sie die EKG-Elektroden auf die Länge, die der Größe der Maus entspricht. Bei einer 12 Wochen alten männlichen schwarzen Sechsermaus (C57BL/6J) mit einem Gewicht von ~30 g kürzen Sie die positive Leitung (rot) mit einer Schere auf eine Länge von ~45 mm und die negative Leitung (farblos) auf eine Länge von ~40 mm.HINWEIS: Diese Werte dienen zur Orientierung und müssen bei Bedarf angepasst werden (Abbildung 2). Entfernen Sie ca. 6 mm des Silikonschlauchs der EKG-Ableitung mit einem Skalpell, um den Draht freizulegen. Decken Sie die Spitzen des Drahtes mit überschüssigem Schlauch ab und lassen Sie einen ~ 2 mm Teil des EKG-Drahtes frei, um elektrische Signale aufzuzeichnen. Befestigen Sie den Silikonschlauch mit nicht resorbierbarem 5-0-Seidennahtmaterial (Abbildung 2A). Notieren Sie sich die Seriennummer des Senders im Betriebsprotokoll (Supplemental File 1). Hydratisieren Sie den Transmitter in warmer, steriler 0,9%iger NaCl-Lösung. Wiegen Sie die Maus und notieren Sie ihr Gewicht. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Sterilisieren Sie sie während der Operation und zwischen der Operation verschiedener Tiere durch trockene Hitze mit einem heißen Glasperlensterilisator.Anmerkungen: Chirurgische Instrumente müssen vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur abgekühlt werden, um Hautverbrennungen zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Arbeitsbank, um aseptische Bedingungen zu gewährleisten. 2. Chirurgische Implantation von telemetrischen Sendern für kombinierte EKG- und Blutdruckmessungen Dissektion der linken A. carotis communis.Betäubung einer Maus durch intraperitoneale Injektion einer Anästhesiemischung (100 mg/kg Ketamin; 15 mg/kg Xylazin; 1 mg/kg Acepromazin). Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist, bevor Sie mit der Operation beginnen. Verwenden Sie einen Trimmer, um den Operationsbereich von unterhalb des Kinns in Richtung der transversalen Brustmuskeln zu rasieren. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine temperaturgesteuerte OP-Platte, die auf 37 °C eingestellt ist. Sichern Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband und überwachen Sie kontinuierlich die Körpertemperatur mit einem Rektalthermometer (Abbildung 2C). Wenn die Körpertemperatur unter 37 °C fällt, decken Sie den Körper des Tieres während der Operation mit steriler Baumwollgaze ab. Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen des Tieres während der Narkose zu schützen. Tragen Sie Enthaarungscreme auf den zuvor rasierten Operationsbereich auf. Haare und Enthaarungscreme mit einem Wattepad und warmem Wasser nach 3-4 Minuten entfernen. Achten Sie darauf, dass die Haut sauber und frei von Haarresten und Enthaarungscreme ist, damit die Wunde während der Operation nicht kontaminiert wird. Desinfizieren Sie die Haut mit mehreren abwechselnden Runden Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Peeling, gefolgt von Alkohol. Legen Sie das Tier unter ein Präpariermikroskop und legen Sie ein steriles Tuch um den Operationsbereich. Machen Sie einen 1-1,5 cm langen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut des Halses, beginnend direkt unter dem Kinn. Bemühen Sie sich, den Schnitt so gerade wie möglich zu machen. (Abbildung 2D).HINWEIS: Bei den folgenden Schritten muss das Operationsgebiet durch regelmäßiges Auftragen von sterilem, warmem (37 °C) 0,9 % NaCl feucht gehalten werden. Schaffen Sie einen subkutanen Raum auf beiden Seiten des Schnitts, indem Sie die Haut mit einer stumpfen Dissektionsschere vom darunter liegenden Bindegewebe trennen. Achten Sie darauf, die Haut mit der Pinzette nicht zu stark einzuklemmen, da dies zu Nekrosen und zu einer gestörten Wundheilung nach der Operation führen kann. Trennen Sie die Ohrspeicheldrüse und die Unterkieferdrüsen mit Watteapplikatoren, um die Muskulatur über der Luftröhre freizulegen. Die linke Speicheldrüse wird mit einer gekrümmten Dissektionszange zurückgezogen, um die linke Halsschlagader zu identifizieren, die sich lateral der Luftröhre befindet (Abbildung 2E). Präparieren Sie die Halsschlagader vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette aus dem angrenzenden Gewebe. Achten Sie darauf, den Vagusnerv, der entlang des Gefäßes verläuft, nicht zu verletzen. Setzen Sie die stumpfe Dissektion fort, um die linke Halsschlagader auf eine Länge von etwa 10 mm freizulegen und sie vollständig von der vaskulären Faszie und dem Vagusnerv zu trennen (Abbildung 2F). Führen Sie eine nicht resorbierbare 5-0-Seidennaht unter den isolierten Teil der Halsschlagader, während Sie das Blutgefäß mit einer gebogenen Pinzette leicht anheben, um die Reibung zwischen der Naht und der Halsschlagader zu verringern, da dies die Gefäßwand leicht beschädigen könnte. Platzieren Sie die Naht kranial, nur proximal zur Bifurkation der Halsschlagader, bilden Sie einen Knoten und binden Sie ihn zusammen, um das Gefäß dauerhaft zu ligieren (Abbildung 2G). Befestigen Sie beide Enden der kranialen Okklusionsnaht mit chirurgischem Klebeband am Operationstisch. Führen Sie eine zweite Okklusionsnaht unter die Halsschlagader und platzieren Sie sie kaudal in ~5 mm Abstand zur Schädelnaht (Abbildung 2H). Es wird für einen vorübergehenden Verschluss des Blutflusses während der Kanülierung der Arterie benötigt. Binden Sie daher einen lockeren Knoten und fixieren Sie beide Nahtenden mit chirurgischem Klebeband. Positionieren Sie eine dritte Naht (sichere Naht) zwischen der kranialen und kaudalen Okklusionsnaht und machen Sie einen lockeren Knoten (Abbildung 2I). Diese Naht wird benötigt, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten, während die Arterie kanüliert wird. Klebe ein Ende der Naht an den Operationstisch. Kanülierung der linken A. carotis communis.HINWEIS: Der Sensorbereich des Blutdruckkatheters befindet sich 4 mm vom distalen Ende entfernt und besteht aus einem Schlauch, der eine nicht komprimierbare Flüssigkeit und ein biokompatibles Gel enthält (Abbildung 2B). Da dieser Bereich sehr empfindlich ist, achten Sie darauf, dass er frei von Luftblasen ist und berühren Sie ihn während des Eingriffs zu keinem Zeitpunkt.Biegen Sie die Spitze einer 24-G-Nadel in einem Winkel von ~100°, um sie als Kathetereinführhilfe zu verwenden. Ziehen Sie vorsichtig an der kaudalen Verschlussnaht und fixieren Sie sie mit Spannung, um den Blutfluss vorübergehend zu stoppen und die Arterie leicht anzuheben. Mit der gebogenen Nadel vorsichtig in die Arterie proximal der kranialen Okklusionsnaht einstechen (Abbildung 2J). Fassen Sie den Katheter mit einer Gefäßkanülenzange, führen Sie ihn in den kleinen Einstich ein und lassen Sie ihn langsam in das Gefäß gleiten. Ziehen Sie die gebogene Nadel gleichzeitig vorsichtig zurück (Abbildung 2K). Wenn der Katheter die kaudale Okklusionsnaht erreicht, ziehen Sie die sichere Naht leicht fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2L). Lösen Sie die kaudale Okklusionsnaht, so dass der Katheter weiter bewegt werden kann, bis seine Spitze im Aortenbogen positioniert ist.HINWEIS: Achten Sie darauf, die richtige Einführlänge des Katheters zu bestimmen, da diese von der Größe der Maus abhängt. Für männliche Mäuse mit einem C57BL/6J-Hintergrund im Alter von 12 Wochen und ~30 g Körpergewicht empfehlen wir, den Katheter so lange einzuführen, bis die integrierte Kerbe die kraniale Okklusionsnaht erreicht. Die korrekte Einführtiefe und Platzierung des Katheters für die spezifische Mauslinie kann nach der Euthanasie des Tieres überprüft werden. Sobald der Katheter richtig positioniert ist, befestigen Sie ihn mit allen drei Nähten und schneiden Sie die Enden so kurz wie möglich ab. Ziehen Sie die Knoten nicht zu fest, da dies den zerbrechlichen Blutdruckkatheter beschädigen könnte. Abbildung 2: Implantation eines kombinierten EKG- und Blutdrucktransmitters – Kanülierung der linken Halsschlagader . (A) Der Telemetriesender besteht aus einem Druckkatheter, zwei Biopotentialelektroden und dem Gerätekörper. (B) Schematische Darstellung des Druckkatheters. Der Sensorbereich besteht aus einer nicht kompressiblen Flüssigkeit und einem biokompatiblen Gel. Der Katheter muss in die Halsschlagader eingeführt werden, bis sich die Kerbe auf Höhe der kranialen Verschlussnaht befindet, um die richtige Position im Blutgefäß zu gewährleisten. (C) Anästhesierte C57BL/6J-Maus, vorbereitet für die chirurgische Transmitterimplantation. (D-L) Bildsequenz zeigt den chirurgischen Eingriff zur Kanülierung der linken Halsschlagader. (D) Schnitt der zervikalen Haut. (E) Freiliegende Luftröhre zur Identifizierung der linken Halsschlagader, die sich lateral der Luftröhre befindet. (F) Stumpfe Dissektion, um die Arterie vom benachbarten Gewebe und dem Vagusnerv zu isolieren. (G) Permanente Ligatur der linken Halsschlagader mit kranialer Okklusionsnaht. (H) Spannung, die auf die kaudale Okklusionsnaht ausgeübt wird, um den Blutfluss vorübergehend zu stoppen. (I) Sichern Sie die Naht, um den Katheter während der Kanülierung an Ort und Stelle zu halten. (J) Kanüle mit gebogener Spitze zum Einführen des Katheters in das Blutgefäß. (K) Der Druckkatheter wird in die Halsschlagader eingeführt. (L) Die Katheterspitze wird im Aortenbogen positioniert und der Katheter mit der Mittelnaht gesichert. Maßstabsbalken in D – L zeigt 4 mm. Nachdruck von16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Platzierung des Telemetriegerätekörpers in einer subkutanen Tasche an der linken Flanke der Maus (Abbildung 3).Bilden Sie vom Hals aus einen subkutanen Tunnel, der auf die linke Flanke des Tieres gerichtet ist, und formen Sie mit einer kleinen, stumpfen Präparierschere einen kleinen Beutel (Abbildung 3B). Spülen Sie den Tunnel mit einer 1-ml-Spritze, die mit warmer, steriler 0,9%iger NaCl-Lösung gefüllt ist, und geben Sie ~300 μl der Lösung in den Beutel (Abbildung 3C). Heben Sie die Haut vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette an und führen Sie den Körper des Sendegeräts in den Beutel ein (Abbildung 3D). Achten Sie bei diesem Schritt sehr darauf, den Blutdruckkatheter nicht aus der Halsschlagader zu ziehen. Platzierung der EKG-Ableitungen in Einthoven II-Konfiguration.Bilden Sie mit einer stumpfen Präparierschere einen dünnen Tunnel zum rechten Brustmuskel und legen Sie die negative (farblose) Mine mit einer stumpfen Pinzette in den Tunnel. Fixieren Sie das terminale Ende der Elektrode mit einem Stich am Brustmuskel mit resorbierbarem 6-0-Nahtmaterial (Abbildung 3E). Bilden Sie eine Schlaufe in der positiven (roten) Elektrode, positionieren Sie ihre Spitze im linken Bereich der Schwanzrippe und sichern Sie ihre Position mit einer Naht aus resorbierbarem 6-0-Nahtmaterial.HINWEIS: Es ist wichtig, dass beide Elektroden über ihre gesamte Länge flach am Körper anliegen, um Gewebereizungen zu vermeiden (Abbildung 3F). Verschließen Sie die Haut mit einzelnen Knoten mit nicht resorbierbarem 5-0-Nahtmaterial (Abbildung 3H). Tragen Sie zusätzlich eine kleine Menge Gewebekleber auf jeden Knoten auf, um zu verhindern, dass das Tier in die Naht beißt, und um eine Dehiszenz zu verhindern. Tragen Sie Povidon-Jod-Hydrogel 10% auf die Wunde auf, um eine Wundinfektion während der Genesungsphase zu verhindern. Zur vorbeugenden Schmerzlinderung werden 5 mg/kg Carprofen in 0,9 % NaCl subkutan injiziert, während die Maus noch unter Narkose steht. Stellen Sie eine Heizplattform auf 39 ± 1 °C ein und legen Sie die Maus in einen separaten Gehäusekäfig. Positionieren Sie eine Hälfte des Käfigs für 12 Stunden nach der Operation auf der Plattform und setzen Sie die Maus in den warmen Bereich. Wenn das Tier aus der Narkose erwacht, hat es die Möglichkeit, im warmen Bereich zu bleiben oder in den kühleren Teil des Käfigs zu wechseln. Abbildung 3: Implantation eines kombinierten EKG- und Blutdrucktransmitters – subkutane Platzierung der EKG-Elektroden und des Gerätekörpers . (A) Maus nach dem Einführen des Blutdruckkatheters. Die Katheterposition wird durch die Okklusionsnähte gesichert. (B) Bildung einer subkutanen Tasche an der linken Flanke des Tieres mit einer stumpfen Schere. (C) Der Beutel wird mit ~300 μL warmer steriler Kochsalzlösung gespült. (D) Der Vorrichtungskörper wird in die Unterhauttasche gelegt. (E) Das terminale Ende der negativen Elektrode (farblos) wird mit resorbierbarem Nahtmaterial am rechten Brustmuskel fixiert. (F) Fixierung der positiven Elektrode (rot) an den linken Zwischenrippenmuskeln. (G) Platzieren einer permanenten Naht am Brustmuskel, um die Position der EKG-Elektroden zu sichern. (H) Maus nach dem Schließen der Haut. Die subkutanen Positionen der EKG-Elektrodenspitzen sind durch rote Kreise gekennzeichnet. Zu Demonstrationszwecken wurde ein totes Tier verwendet, um diese Bilder aufzunehmen. Bitte befolgen Sie sterile Praktiken, wenn Sie ein lebendes Tier verwenden. Nachdruck vom16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. NachsorgeZur postoperativen Schmerzlinderung werden 3-5 Tage lang alle 12 h 5 mg/kg Carprofen in 0,9% NaCl subkutan injiziert, bis die Wunde verheilt ist. Injizieren Sie 10 μl/g warme Ringer-Laktat-Lösung intraperitoneal, um das Tier vor Austrocknung zu schützen. Lassen Sie die Maus 2-3 Wochen lang ruhen, bevor Sie die ersten telemetrischen Messungen durchführen. Überwachen Sie sorgfältig den allgemeinen Gesundheitszustand, die Wundheilung, das Körpergewicht sowie die Nahrungs- und Wasseraufnahme während der Genesungsphase. Am Ende des Experiments wird die Maus durch Einatmen von Kohlendioxid (CO2) eingeschläfert.HINWEIS: Eine Zervixluxation oder Enthauptung wird nicht als Euthanasiemethode empfohlen, da dies Teile des EKG- und Blutdrucksenders beschädigen könnte. Datenerfassung.Ergreifen Sie Maßnahmen, um akustisches und elektronisches Rauschen während der Datenaufzeichnung zu vermeiden. Beschränken Sie außerdem den Zugang des Personals während der Datenerfassung und führen Sie alle Haltungsverfahren vor dem Experiment durch. Stellen Sie den Käfig des Tieres auf die Telemetrie-Empfängerplatte und schalten Sie den Telemetriesender ein, indem Sie einen Magneten in die Nähe des Tieres bringen. Mit der Datenerfassungssoftware können Sie kontinuierliche EKG-, Blutdruck- und Aktivitätsaufzeichnungen über einen Zeitraum von 72 Stunden (12-stündiger Dunkel-Hell-Zyklus) erfassen (Abbildung 4). Analyse des circadianen Rhythmus von Herzfrequenz, Blutdruck und Aktivität.Überprüfen Sie das Vorhandensein eines regelmäßigen circadianen Rhythmus von HF, Blutdruck und Aktivität mit der Datenerfassungssoftware12 (Abbildung 5). Datenanalyse inkl. Bestimmung der Barorezeptorsensitivität mittels Sequenzmethode mit EKG- und Blutdruckanalyse-Software.Exportieren Sie Blutdruck- und Herzfrequenzdaten aus der Datenerfassungssoftware in eine EKG- und Blutdruckanalysesoftware (Supplemental File 2). Verwenden Sie die folgende Befehlsfolge: Öffnen Sie die EKG- und Blutdruckanalysesoftware > Datei > Rohdaten aus dem Konverter > Nicht-IOX-Rohdaten konvertieren. Klicken Sie im neuen Fenster auf Datei > Dataquest ART4-Daten laden. Wieder öffnet sich ein neues Fenster, wählen Sie die Datendatei für den Export aus > Neues Fenster öffnet sich, wählen Sie Tier aus der Liste “Themen” und wählen Sie EKG und Blutdruck aus der “Wellenformliste” aus und drücken Sie OK. Wählen Sie Tiere aus, aus denen Daten konvertiert werden sollen, indem Sie auf Daten konvertieren > IOX-Binärdateidatei erstellen klicken. Öffnen Sie die IOX-Binärstellendatei in der EKG- und Blutdruckanalysesoftware, indem Sie die folgende Befehlsfolge verwenden: Datei > IOX-Daten laden > Wählen Sie Blutdruck- und EKG-Trace aus > drücken Sie das grüne Häkchen.HINWEIS: Die folgenden Datenverarbeitungsparameter sind für Daten von Wildtyp-Mäusen optimiert und sollten prinzipiell für alle Mausmodelle geeignet sein, die im präklinischen Bereich verwendet werden. Eine Anpassung dieser Parameter kann jedoch erforderlich sein, wenn mit bestimmten experimentellen Modellen gearbeitet wird, z. B. Mäusen mit extrem hohen oder niedrigen HR- und/oder Blutdruckwerten oder verschiedenen Nagetierarten. In jedem Fall müssen die Parameter der Datenverarbeitung sorgfältig überprüft werden, um sicherzustellen, dass sie für das untersuchte Modell geeignet sind. Einstellungen für EKG-, Blutdruck- und BRS-Analyse finden Sie in der Zusatzdatei 3,4. Passen Sie für die BRS-Analyse bei Mäusen die BRS-Parameter so an, dass nur Sequenzen von drei (oder mehr) Schlägen erkannt werden, die eine Verzögerung zwischen SBP und RR von einem Schlag aufweisen, und legen Sie den Schwellenwert für SBP- und RR-Änderungen auf 0,5 mmHg und 2 ms fest. Stellen Sie sicher, dass der Korrelationskoeffizient der Steigung der Regressionsgeraden aus RR/SBP-Diagrammen größer als 0,75 ist, und analysieren Sie nur Abschnitte, die einen stabilen Sinusrhythmus aufweisen. Stellen Sie die Parameter für die EKG-, Blutdruck- und BRS-Analyse entsprechend ein, indem Sie die folgende Befehlsfolge verwenden: Optimieren > Analyseeinstellungen > neues Fenster öffnet sichEKG-Einstellungen (Rechtsklick in das Fenster “EKG-Modus und Signalfilterung” (Supplemental File 3)). Legen Sie die Parameter wie hier beschrieben fest. Modus: EKG, nur RR, Filtermodus: automatisch, je nach eingestellter Herzfrequenz, Erwartete Herzfrequenz: bpm > 300, Breite des Basislinien-Entfernungsfilters (ms): 100,00, Filterbreite zur Rauschunterdrückung: 1,00 ms, Notch-Filter: 50,0 Hz, Spike-Entfernungsfilter: aus, Drop-out-Erkennungsmodus: aus, Max. RR-Längen (ms): 900,00, RR von angepassten R-Peaks: aus, RR_only Einstellungsmodus: Xsmall: Maus, R-Peakbreite (ms): 10,00, PR-Breite (ms): 20,00, RT-Breite (ms): 50,00, Max. Inter-Beat-Artefakt (%): 50,00, Verhältnis von R zu anderer Amplitude: 3,00, R-Peak-Vorzeichen: positiv und Compute extra parameter: off Für die Blutdruckeinstellungen (Blutdruck, Druckeinstellungen) klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Fenster “Blutdruckanalysator” (Supplemental File 4). Legen Sie die Parameter wie hier beschrieben fest. Filterbreite zur Rauschunterdrückung (ms): 10.00, Breite des abgeleiteten Filters (ms): 6.00, Notch-Filter: 50.0 Hz, Spike-Entfernungsfilter: aus, Validierungsschwelle (Kal.-Einheit): 12.00, Unterdrückungsschwelle (Kal.-Einheit): 8.00, Ableitung beim beginnenden Aufschlag (cal U/s): 10.00, Unterdrückungsgrenzen: aus, Verzögerung vom Referenz-EKG: benutzerdefiniertes Fenster, Min. Verzögerung vom EKG-Rpeak (ms): 10.00, Max. Verzögerung vom EKG-Rpeak (ms): 250.00, Conduct_time_1 von Markierung: nicht berechnet, Conduct_time_2 von Markierung: nicht berechnet, BR (Atemfrequenz): aus, BRS (Baroreflexempfindlichkeit): ein, Minimale fortlaufende Schlagzahl: 3, Latenzschwebungszahl: 1, Druckwert: SBP, Markierung zur Berechnung des Impulsintervalls: R, Minimale Druckvariation (caIU): 0,50, Minimale Intervallvariation (ms): 2,00, Minimale Korrelation: 0,75 Durchsuchen Sie das Aktivitätssignal auf eine 3-stündige Sequenz mit geringer Aktivität. Führen Sie die BRS-Analyse in diesem Zeitfenster durch, da eine hohe Aktivität der Tiere die Korrelation zwischen Blutdruck und RR beeinträchtigt. Führen Sie während dieses 3-Stunden-Zeitfensters eine BP- und RR-Analyse durch, während Sie die 3-Stunden-Analyse in 10-Minuten-Schritte unterteilen. Führen Sie die BRS-Analyse mit der folgenden Befehlsfolge durch: Öffnen Sie das Fenster BRS-Analyse > > BRS-Analyse anzeigen. Dadurch wird das BRS-Analysefenster geöffnet. Untersuchen Sie jede Sequenz, die im BRS-Analysepanel angezeigt wird, manuell und schließen Sie ektopische Schläge, Sinuspausen, arrhythmische Ereignisse oder verrauschte Daten aus. Stellen Sie sicher, dass Sie jeden einzelnen Schlag solcher Sequenzen ungültig machen, um sie erfolgreich von der Analyse auszuschließen. Exportieren Sie die Ergebnisse der BRS-Analyse in eine Tabellenkalkulationsdatei (Ergebnisdatei). Ändern Sie die Parameter, die in die Tabellenkalkulationsdatei exportiert werden, indem Sie die folgende Befehlsfolge verwenden (Ergänzende Dateien 5-7):Passen Sie > Parameter in der Liste/Datei > Abschnitten > txt (Supplemental File 5) an. Wählen Sie den Abschnitt “Beats” und alle anderen Abschnitte, die interessante Informationen enthalten, mit Ausnahme des ungültigen Beats-Abschnitts. Optimieren Sie > Parameter in list/to file > Schritte > txt (Supplemental File 6). Wählen Sie die Schrittwerte aus, die exportiert werden sollen. Tune > Parameter in list/to file > beats -> txt (Supplemental File 7). Stellen Sie sicher, dass der Beats-Abschnitt der Datei mindestens die folgenden Daten für jeden einzelnen Beat enthält. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=aufeinanderfolgende Schlagintervalle der Sequenz), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR des nachfolgenden Schlages) Klicken Sie dann auf Datei > Ergebnisdatei speichern. Sortieren Sie die exportierten Daten mit der Filterfunktion von Excel (Supplemental File 8) nach Auf- und Abwärtssequenzen. Berechnen Sie die Anzahl der Sequenzen, die mittlere BRS-Steigung, die Standardabweichung und den Standardfehler der BRS-Steigung für Aufwärts- und Abwärtssequenzen separat. Berechnen Sie auch die Gesamtzahl der Sequenzen pro 1000 Schläge.HINWEIS: Eine Tabellenkalkulationsvorlage (TemplateBRS) zur automatisierten Sortierung und Analyse von Auf- und Abwärtssequenzen ist im Nachtrag (Supplemental File 8) enthalten und erleichtert die Analyse. Durch Anpassen der Filterfunktion können Sie Sequenzen nach verschiedenen Zählzeiten sortieren (z. B. Drei- oder Vier-Takt-Sequenzen). Weitere Informationen finden Sie in den Ergänzungsdateien 9-13.Öffnen Sie die Ergebnisdatei und die Excel-Datei TemplateBRS (Supplemental File 8). Kopieren Sie die Daten der folgenden Spalten aus der Ergebnisdatei: (Druck)_BRS_deltaP, (Druck)_BRS_# und (Druck)_BRS_slope (Zusatzdatei 9). Fügen Sie die Daten in die entsprechenden Spalten der Tabellen “Aufwärtssequenzen” und “Abwärtssequenzen” in der TemplateBRS-Datei (Zusatzdatei 10) ein. Kopieren Sie außerdem die Daten der Spalte (Druck)_BRS_SBP aus der Ergebnisdatei (Supplemental File 11) und fügen Sie sie in die Tabelle “Alle Sequenzen” in der TemplateBRS-Datei (Supplemental File 12) ein.HINWEIS: Die Zahl in der Spalte (Pressure)_BRS_# wird nur beim letzten Schlag einer Sequenz aufgeführt und gibt die Länge der Sequenz an. Auf- und Abwärtssequenzen können durch das Vorzeichen des (Druck)_deltaP Wertes unterschieden werden. Negative Werte für den zweiten und dritten Schlag einer Sequenz mit drei Schlägen weisen auf eine Abwärtssequenz hin. Positive Werte weisen jeweils auf eine Aufwärtssequenz hin. Filtern Sie die kopierten Daten mit den Standardfiltereinstellungen. Klicken Sie auf das Filtersymbol in der Spalte (Druck)_BRS_# und drücken Sie “ok” (Supplemental File 13). Wenden Sie diesen Schritt auf die Tabellen “Aufwärtssequenzen” und “Abwärtssequenzen” an.HINWEIS: Die Tabelle filtert nach Sequenzen mit drei Schlägen. Wenn andere Sequenzlängen gewünscht werden, muss die Einstellung dieser Spalte im Dropdown-Menü geändert werden. Die Berechnungen für die Anzahl der Sequenzen, die mittlere BRS-Steigung, die Standardabweichung und den Standardfehler der BRS-Steigung werden in den grünen Kästchen der Tabellen “Aufwärtsfolgen” und “Abwärtsfolgen” angezeigt. Berechnungen für die Gesamtzahl der Sequenzen pro 1000 Schläge werden im grünen Kästchen der Tabelle “Alle Sequenzen” angezeigt.

Representative Results

Positive Ergebnisse für EKG- und Blutdruck-RohdatenMit diesem Protokoll können qualitativ hochwertige EKG- und Blutdruckdaten erfasst werden (Abbildung 4 und Supplemental File 14), die nicht nur eine präzise BRS-Analyse, sondern auch die Analyse eines breiten Spektrums von EKG- oder BP-abgeleiteten Parametern ermöglichen, z. B. EKG-Intervalle (Abbildung 4B, oberes Bild), Blutdruckparameter (Abbildung 4B, unteres Bild), Herzfrequenz und Blutdruckvariabilität, Arrhythmie-Erkennung usw.12,13,14,15. Abbildung 4: Telemetrische EKG- und Blutdruckaufzeichnungen. (A) Repräsentativer, qualitativ hochwertiger EKG-Verlauf (oberes Bild) und entsprechende hochwertige Roh-Blutdruckaufzeichnungen (unteres Bild). (B) Vergrößerung der EKG-Kurven (oberes Feld). P-Welle, QRS-Komplex, T-Welle und RR-Intervall werden angezeigt. Vergrößerung der entsprechenden Blutdruckdaten (unterer Bereich). Diastolischer Blutdruck (DBP) und systolischer Blutdruck (SBP) sind indiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Positive Ergebnisse für den circadianen RhythmusEine gesunde Maus, die sich ausreichend von der Operation erholt hat, zeigt einen physiologischen Anstieg der Aktivität, der Herzfrequenz und des Blutdrucks während der Aktivitätsphase (Dunkelphase) (Abbildung 5). Viele verschiedene Faktoren können diesen regelmäßigen circadianen Rhythmus stören. Dazu gehören psychische Belastungen, akustisches oder elektrisches Rauschen und Schmerzen. Zum Beispiel würde ein akuter Schmerzzustand unmittelbar nach der Operation zu einem Anstieg der Herzfrequenz bei gleichzeitiger Abnahme der Aktivität führen. Daher ist der circadiane Rhythmus ein wichtiger Indikator für die Gesundheit und das Wohlbefinden der Tiere und sollte vor der BRS-Analyse routinemäßig überprüft werden. Abbildung 5: Analyse von Langzeit-Telemetriemessungen zur Bestimmung von circadianen Rhythmusvariationen. Der zirkadiane Rhythmus von Herzfrequenz (A), Aktivität (B), systolischem Blutdruck (C) und diastolischem Blutdruck (D) wurde von 9 männlichen Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen während 12-stündiger Hell- und Dunkelzyklen gemittelt. Graue Flächen stellen die Aktivitätsphase (Dunkelphase) und weiße Flächen die Ruhephase (Hellphase) der Tiere dar. Alle Parameter sind während der Aktivitätsphase (Dunkelphase) des Tieres physiologisch erhöht. Die Daten werden als Mittelwert +/- SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Positive Ergebnisse für BRS-AnalyseNach Durchführung der Analyse, wie im Protokollabschnitt 2.8 beschrieben, erkennt die Software Auf- bzw. Abwärtssequenzen. Die verwendete Methode wird als Sequenzmethode bezeichnet, da Änderungen der SBP- und RR-Intervalle während kurzer Sequenzen von drei oder mehr Schlägen mit einem spontanen Anstieg oder Abfall des SBP von Schlag zu Schlag untersucht werden (Abbildung 6). Eine kontinuierliche Erhöhung des SBP über drei Herzschläge führt zu einer reflexartigen Erhöhung der parasympathischen Aktivität und verlangsamt in der Folge die Herzfrequenz, was längeren RR-Intervallen entspricht. Die Latenz für die Reflex-HR-Adaption beträgt einen Schlag. Eine solche Sequenz ist in 6A dargestellt und als Aufwärtssequenz definiert. Im Gegensatz dazu wird eine kontinuierliche Abnahme des SBP über drei Schläge mit parallelem Anstieg der Herzfrequenz (Abnahme des RR-Intervalls) als Abwärtssequenz definiert (Abbildung 6B). Um die Korrelation zwischen RR und SBP auszuwerten, werden beide Parameter gegeneinander aufgetragen und die Steigung (ms/mmHg) der linearen Regressionsgeraden für jede Sequenz berechnet (Abbildung 6A,B, untere Tafeln). Nach der Sortierung nach Auf- und Abwärtssequenzen kann die durchschnittliche Anzahl der Sequenzen pro 1000 Schläge (Abbildung 6C) und die durchschnittliche Verstärkung der spontanen BRS für Auf- bzw. Abwärtssequenzen berechnet werden (Abbildung 6D,E). Die Verstärkung der spontanen BRS spiegelt sich in der Steigung der linearen Regressionsgeraden wider, die aus der RR/SBP-Beziehung berechnet wird. Die Abweichung von normalen BRS-Werten kann verschiedene Ursachen haben. Dazu gehören Veränderungen des ANS-Inputs oder Veränderungen in der Reaktionsfähigkeit des Sinusknotens auf den Input des autonomen Nervensystems. In Abbildung 6 ist ein erhöhtes BRS in einem Mausmodell für das Sick-Sinus-Syndrom (SSS) mit übertriebener Reaktionsfähigkeit des Sinusknotens auf vagalen Input dargestellt11. Abbildung 6: Schätzung der BRS mit der Sequenzmethode. (A) Repräsentative Blutdruckspur einer Wildtyp-C57BL/6J-Maus während einer Aufwärtssequenz von drei aufeinanderfolgenden Schlägen (oberes Bild), verbunden mit einer parallelen Zunahme des RR-Intervalls (mittleres Bild), was einer Abnahme der Herzfrequenz entspricht. Die RR-Intervalle wurden gegen den SBP (unteres Bild) aufgetragen. Die Steigung der Regressionsgeraden (rote Linie) für die im oberen und mittleren Bild dargestellte Aufwärtssequenz (WT, schwarze Kreise) betrug 4,10 ms/mmHg. Eine repräsentative RR/SBP-Beziehung des Sick-Sinus-Syndrom-Mausmodells ergab eine erhöhte Steigung von 6,49 ms/mmHg, was auf ein erhöhtes BRS (SSS, graue Kreise) hinweist. (B) Repräsentative Abwärtssequenz einer Wildtyp-Maus mit einem Abfall des SBP (oberes Bild) und einer anschließenden Abnahme des RR-Intervalls (mittleres Bild), was zu einer BRS-Steigung von 4,51 ms/mmHg führt (unteres Bild; WT, schwarze Kreise). Eine repräsentative RR/SBP-Beziehung des Sick-Sinus-Syndrom-Mausmodells (SSS, graue Kreise) mit einer Steigung von 7,10 ms/mmHg. Die Ausrichtung der roten Pfeilspitzen zeigt die Richtung der Sequenzen an (Aufwärts- oder Abwärtsfolge). (C) Gesamtzahl der Sequenzen pro 1000 Schläge für WT- und SSS-Mäuse. (D) Mittlere Steigung der RR/SBP-Beziehung für Aufwärtssequenzen für WT- und SSS-Mäuse. (E) Mittlere Steigung der RR/SBP-Beziehung für Down-Sequenzen für WT- und SSS-Mäuse. Die Statistik in (C-E) wurde anhand der Ergebnisse von sechs männlichen WT-Tieren und acht männlichen Tieren des Sick-Sinus-Syndrom-Mausmodells durchgeführt. Boxplots zeigen den Median, die Gültigkeitsdauer von 25/75 und den Min/Max-Wert. Offene Symbole stellen den Mittelwert dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Negatives Ergebnis für RohdatenqualitätInsbesondere in Phasen höherer Aktivität kann die Signalqualität abnehmen (Abbildung 7 und Supplemental Files 15,16). Dies kann durch eine vorübergehende Verschiebung oder eine falsche Position des Blutdruckkatheters oder der EKG-Elektroden oder beider aufgrund einer Bewegung des Tieres verursacht werden. Außerdem kann die Aktivität der Skelettmuskulatur über die EKG-Ableitungen erkannt werden und Rauschen induzieren (Abbildung 7B, oberes Bild). Mit den oben beschriebenen Softwareeinstellungen werden diese qualitativ minderwertigen Beats nicht erkannt und daher von der Analyse ausgeschlossen. Dennoch ist eine manuelle Inspektion der analysierten Rohdaten zwingend erforderlich. Abbildung 7: Beispiele für Rohsignale von geringer Qualität. (A) Das EKG-Signal (oberes Bild) wird mit guter Qualität erkannt, aber die Qualität des Blutdrucksignals (unteres Bild) ist niedrig. (B) Die Qualitäten des EKG-Signals (oberes Bild) und des Blutdrucksignals (unteres Bild) sind nicht ausreichend. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Negative Ergebnisse für BRS-AnalyseDie im Protokollabschnitt 2.8.3 aufgeführten BRS-Analyseeinstellungen sind im Allgemeinen für die schnelle und korrekte Erkennung von Auf- und Abwärtssequenzen unerlässlich. Der minimale Korrelationskoeffizient für die Regressionslinie wird auf 0,75 festgelegt. Eine zu niedrige Einstellung der Werte für den minimalen Korrelationskoeffizienten führt zu falschen Erkennungen von Sequenzen, die keine Baroreflexaktivität widerspiegeln, sondern eher aus arrhythmischen Schlägen resultieren (Abbildung 8). Für die BRS-Analyse müssen nur Episoden mit stabilem Sinusrhythmus analysiert werden. Eileiterische Schläge oder andere arrhythmische Ereignisse, z. B. Sinuspausen, können mit der HRV-Option der EKG- und Blutdruckanalyse-Software gefunden werden und müssen ungültig gemacht werden. Abbildung 8: Sequenzen, die nicht die Baroreflexaktivität widerspiegeln . (A) EKG-Verlauf einer Maus mit leichter Sinusdysrhythmie. (B) BP-Aufzeichnung, die einen spontanen Anstieg des SBP zeigt. (C) Entsprechende RR-Intervalle deuten auf eine Abnahme der HR bei Anstieg des Blutdrucks hin. (D) Diagramm des SBP und der entsprechenden RR-Intervalle. Der niedrige Korrelationskoeffizient der Regressionsgeraden deutet darauf hin, dass die HR-Reduktion nicht durch die Aktivität des Baroreflexes, sondern durch eine Sinusdysrhythmie verursacht wurde. (E) Rohe EKG-Kurve, die eine Sinuspause darstellt. (F) Entsprechendes Roh-BP-Signal. Die Sinuspause führt zu einem Abfall des diastolischen Blutdrucks. Der systolische Blutdruck des nachfolgenden Schlages wird nahezu nicht beeinflusst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Ergänzungsdatei 1: Operationsprotokoll. Vorlage zur Dokumentation des chirurgischen Eingriffs und der Nachsorge. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 2: Konvertieren von Dataquest A.R.T.-Daten in IOX-Daten für die Analyse in der ecgAUTO-Software. Wählen Sie Tiere in der Probandenliste (links) und Druck und EKG in der Wellenformliste (rechts) aus. Drücken Sie OK, um Daten zu konvertieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 3: EKG-Einstellungen für die BRS-Analyse. Stellen Sie die Parameter wie aufgeführt ein, drücken Sie OK und übernehmen Sie die Konfiguration. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 4: BP-Einstellungen für die BRS-Analyse. Stellen Sie die Parameter wie aufgeführt ein, drücken Sie OK und übernehmen Sie die Konfiguration. Speichern Sie die Konfiguration als Konfigurationsdatei, um die Einstellungen einfach laden zu können. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 5: Parameter im Listen-/Nachdateifenster für “Abschnitte”. Wählen Sie die zu exportierenden Abschnitte unter dem Abschnitt > txt-Header (ausgewählt) aus und klicken Sie auf Übernehmen!. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 6: Parameter im Listen-/Nachdateifenster für “Schritte”. Wählen Sie die zu exportierenden Schrittdaten unter den Schritten > txt-Header (ausgewählt) aus und klicken Sie auf Übernehmen!. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Supplemental File 7: Parameter im Listen-/Nachdateifenster für “Beats”. Wählen Sie die zu exportierenden Werte unter den Beats > txt-Header (ausgewählt) aus und klicken Sie auf Übernehmen!. Für die BRS-Analyse sind die angekreuzten Parameter notwendig. Beachten Sie die Reihenfolge der Auswahl, die durch die Zahlen angegeben wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 8: TemplateBRS-Tabellenkalkulationsdatei. Tabellenkalkulationsvorlage für die automatisierte Sortierung und Analyse von Auf- und Abwärtssequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 9: Kopieren relevanter Daten aus der Ergebnisdatei I. Kopieren Sie die Spalten (Druck)_BRS_deltaP, (Druck)_BRS_# und (Druck)_BRS_slope aus der Ergebnisdatei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 10: Tabellenkalkulationsvorlagendatei (TemplateBRS) zur Datensortierung und -analyse I. Fügen Sie die kopierten Daten in die entsprechenden Spalten der Tabelle “Aufwärtssequenzen” und “Abwärtssequenzen” in der TemplateBRS-Tabellenkalkulationsdatei ein. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsdatei 11: Kopieren relevanter Daten aus der Ergebnisdatei II. Kopieren Sie die Spalte (Druck)_BRS_SBP aus der Ergebnisdatei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Supplemental File 12: Eine Tabellenkalkulationsvorlagendatei (TemplateBRS) für die Datensortierung und -analyse II. Fügen Sie die kopierten SBP-Daten in die Tabelle “Alle Sequenzen” in der TemplateBRS-Tabellenkalkulationsdatei ein, um die Gesamtzahl der Sequenzen zu berechnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Zusatzdatei 13: Filtern und Analysieren der Sequenzen. Öffnen Sie in der Tabelle “Aufwärtssequenzen” der Tabellenkalkulationsdatei TemplateBRS das Dropdown-Menü des Spaltenfilters (Druck)_BRS_# und drücken Sie OK , ohne die Parameter zu ändern. Dadurch werden die Daten automatisch sortiert und die Berechnungen für Sequenzen mit 3 Schlägen aktualisiert. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Tabelle “Down-Sequenzen”. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 14: Screenshot einer qualitativ hochwertigen Aufzeichnung, die mit einer EKG- und Blutdruckanalysesoftware erfasst wurde. Die obere Kurve (EKG) zeigt die Detektion jedes R-Peaks und die untere Kurve (BP) zeigt die Detektion jedes diastolischen Drucks (DP) und systolischen Drucks (SP) Peaks. Bereiche, die unter erfolgreich detektierten Peaks liegen, sind rot markiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Supplemental File 15: Screenshot einer Blutdruckaufzeichnung von geringer Qualität, bei der Blutdruckparameter nur teilweise erkannt werden. Die obere Kurve (EKG) zeigt die Detektion jedes R-Peaks, aber die untere Kurve (BP) zeigt Lücken zwischen den detektierten BP-Peaks. Erkannte Spitzen des diastolischen Drucks (DP) und des systolischen Drucks (SP) sind mit roten Bereichen markiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 16: Screenshot einer EKG- und Blutdruckaufzeichnung von geringer Qualität, bei der EKG- und Blutdruckparameter nicht erkannt werden konnten. Die obere Kurve (EKG) zeigt einen Bereich (violetter Hintergrund), in dem keine EKG-Parameter detektiert werden konnten. Auch die Blutdruckdetektion (untere Kurve) schlug aufgrund der geringen Signalqualität fehl. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Bedeutung der Methode gegenüber Alternativmethoden
In der vorliegenden Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung spontaner BRS mit Hilfe der Sequenzmethode vor. Bei diesem Ansatz werden spontane Blutdruck- und Reflex-HF-Veränderungen verwendet, die durch EKG und Blutdrucktelemetrie gemessen werden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass beide Parameter bei bewussten, sich frei bewegenden, uneingeschränkten Tieren erfasst werden können, ohne die Tiere durch das Betreten des Raumes, in dem die Messungen durchgeführt werden, oder sogar durch die für die Injektion von Medikamenten erforderliche körperliche Interaktion zu stören. Dieser Punkt ist sehr wichtig, da klar gezeigt wurde, dass solche Störungen die Herzfrequenz- und Blutdruckaufzeichnungen stark beeinträchtigen. Zum Beispiel erfordert die Injektion von Medikamenten die Fixierung der Mäuse, was eine maximale Stressreaktion hervorruft, die die Herzfrequenz um bis zu 650-700 Schläge pro Minute erhöht. Um diese Stressreaktionen zu umgehen, wurde BRS zuvor in anästhesierten Mäusen bestimmt. In der Veterinärmedizin verwendete Standardanästhetika wie Ketamin/Xylazin oder Isofluran induzieren jedoch Bradykardie und beeinflussen autonome Reflexreaktionen, was die Aussagekraft dieser Ansätze und die Interpretation der Ergebnisse einschränkt. Um diese Einschränkungen teilweise zu überwinden, wurden implantierbare Drug Delivery Devices, d.h. osmotische Pumpen, eingesetzt, die Wirkstoffe in die Peritonealhöhle abgeben können. Mit osmotischen Pumpen ist es jedoch nicht möglich, einen Bolus mit einer definierten Dosis des Arzneimittels zu applizieren, was die Anwendung solcher Geräte einschränkt. Alternativ komplexe Infusionskatheter¹⁷ kann Mäusen implantiert werden, um Medikamente zu verabreichen. Diese Katheter sind jedoch schwierig zu handhaben und erfordern chirurgische Fähigkeiten, die mit denen vergleichbar sind, die für die Implantation von Telemetriegeräten erforderlich sind, und liefern im Vergleich zu Messungen von spontanem BRS weniger wissenschaftliche Ergebnisse. Neben den technischen Problemen, die mit der Messung von BRS durch Injektion von Medikamenten verbunden sind, gibt es einige Einschränkungen in Bezug auf die Arzneimittelwirkung an sich. Traditionelle Ansätze zur Bestimmung des BRS beinhalten Bolusinjektionen von vasoaktiven Medikamenten. Die Bolusinjektion von Vasokonstriktoren (z. B. Phenylephrin) oder Vasodilatatoren (z. B. Natriumnitroprussid) wurde jedoch als übermäßiger und unphysiologischer Stimulus für die Anpassung der Reflex-HR an Veränderungen des Blutdrucks angesehen¹⁸. Die spontane Aktivität des Barorezeptorreflexes kann auch mit spektralen Methoden quantifiziert werden. Eine dieser Methoden bewertet BRS im Frequenzbereich, indem das Verhältnis zwischen Änderungen der Herzfrequenz und Änderungen des Blutdrucks in einem bestimmten Frequenzband berechnet wird¹⁸^,¹⁹. Andere spektrale Methoden beinhalten die Bestimmung der Transferfunktion von Blutdruck und HR oder die Quantifizierung der Kohärenz zwischen Blutdruck und HR²⁰^,²¹. Diese Methoden erfordern auch die telemetrische Erfassung von spontanen Blutdruck- und HR-Parametern, und obwohl sie für die Bestimmung spontaner BRS geeignet sind, erfordern sie intensive Berechnungswerkzeuge und sind schwierig anzuwenden. Darüber hinaus leiden alle spektralen Methoden unter der Einschränkung, dass nicht-stationäre Signale die Anwendung spektraler Methoden ausschließen. Insbesondere können spektrale Spitzen, die durch Atemrhythmen induziert werden, bei menschlichen Patienten reduziert werden, indem der Patient aufgefordert wird, mit dem Atmen aufzuhören, während dies bei Mäusen offensichtlich nicht möglich ist. Daher ist das Signal-Rausch-Verhältnis bei Mäusen häufig recht gering. Angesichts der Einschränkungen der oben diskutierten Methoden bevorzugen wir die Sequenzmethode zur Bestimmung von BRS in Mäusen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die Tatsache, dass es sich um eine nicht-invasive Technik handelt, die Daten über spontane BRS unter realen Bedingungen liefert²². Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Dauer der mit der Sequenzmethode analysierten Sequenzen mit 3-5 Schlägen recht kurz ist. Die Reflexregulation der HR durch den Vagusnerv erfolgt sehr schnell und innerhalb des Zeitrahmens dieser Sequenzen. Daher ist die Sequenzmethode gut geeignet, um den Beitrag des Vagusnervs zum BRS zu bewerten. Im Gegensatz dazu ist die Regulation durch den Sympathikus viel langsamer. Tatsächlich kann man davon ausgehen, dass während dieser kurzen Sequenzen die Aktivität des sympathischen Nervensystems nahezu konstant ist. Daher ist die Methode so angepasst, dass sie selektiv Reflexveränderungen der HR erkennt, die durch die Aktivität des Vagusnervs ausgelöst werden.

Interpretation von BRS-Daten
Für die Interpretation der BRS-Dysfunktion bzw. der BRS-Daten an sich ist es wichtig, die einzelnen Funktionsebenen zu berücksichtigen, die am Barorezeptorreflex beteiligt sind. Auf neuronaler Ebene können afferente, zentrale oder efferente Komponenten des Reflexes betroffen sein²³. Auf kardiovaskulärer Ebene kann eine verminderte oder übertriebene Reaktionsfähigkeit des Sinusknotens auf ANS-Eingaben vorliegen ^11,24. Eine Änderung auf jeder Ebene könnte zu Änderungen im BRS führen. Um zu untersuchen, ob neuronale und/oder kardiale Mechanismen für die beobachteten Veränderungen im BRS verantwortlich sind, könnten kardiale oder neuronenspezifische Gendeletions-, Knockdown- oder Geneditierungsansätze verwendet werden.

Kritische Schritte im Protokoll
Der anspruchsvollste und kritischste Schritt in diesem Protokoll ist die Präparation und Kanülierung der linken Halsschlagader (Schritt 2.3). Die Spannung der kaudalen Okklusionsnaht muss ausreichend hoch sein, um den Blutfluss vor der Kanülierung vollständig zu stoppen. Andernfalls kann bereits ein kleiner Blutaustritt während der Kanülierung die Sicht stark einschränken oder sogar dazu führen, dass die Maus verblutet. Die Kanülierung sollte auf Anhieb erfolgreich sein. Wenn der erste Versuch fehlgeschlagen ist, ist es jedoch immer noch möglich, die Kanülierung vorsichtig zu wiederholen.

Der Mittellinienschnitt und der subkutane Tunnel vom Hals bis zur linken Flanke (Schritt 2.3) müssen groß genug sein, um den Transmitter ohne Kraftaufwand einzuführen, aber auch so klein wie möglich, um den Transmitter an Ort und Stelle zu halten. Andernfalls muss man es mit Nahtmaterial oder Gewebekleber fixieren. Da Mäuse eine sehr empfindliche Haut haben, kann es zu einer Nekrose der Haut kommen, wenn der Tunnel für den Sender zu klein ist.

Wenn die EKG-Elektroden zu lang sind, um in den subkutanen Tunnel zu passen (Schritt 2.4), ist es notwendig, eine neue Spitze zu bilden, indem die Elektrode auf die richtige Länge gekürzt wird. Die Elektrode muss über die gesamte Länge der Leitung flach am Körper anliegen. Zu lange Elektroden stören die Tiere und sie versuchen, die Wunde zu öffnen, um den Sender zu entfernen, was zu einer Gewebereizung und Wunddehiszenz führt. Zu kurze Leitungen können natürlich nicht verlängert werden und es kann sein, dass in diesem Fall die Elektroden nicht so positioniert werden können, dass sie der Einthoven II-Konfiguration entsprechen. Wir empfehlen daher, die optimale Länge der EKG-Ableitungen bei einer toten Maus des gleichen Geschlechts, Gewichts und genetischen Hintergrunds zu bestimmen.

Mäusen sollte nach der Implantation des Transmitters eine längere Erholungszeit eingeräumt werden, wenn sie keinen normalen circadianen Rhythmus haben und dies nicht der Phänotyp der untersuchten Mauslinie ist (Schritt 2.7). Ein weiterer Grund für gestörte circadiane Rhythmen könnte eine unzureichende akustische Isolierung der Tieranlage oder des Personals, das den Raum während der Messung betritt, sein.

Die Analyse von EKG-, Blutdruck- und BRS-Daten ist unkompliziert (Schritt 2.8). Der kritischste Schritt besteht darin, ektopische Schläge, Sinuspausen, arrhythmische Episoden oder Abschnitte mit minderwertigen Signalen von der Datenanalyse auszuschließen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert [FE 1929/1-1 und WA 2597/3-1]. Wir danken Sandra Dirschl für die hervorragende technische Unterstützung und Julia Rilling für die tierärztliche Beratung.

Materials

Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL	CP-Pharma, Germany	1229	anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe	Wolfram Droh GmbH, Germany	9166017V
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer AG, Germany
Blunt dissecting scissors	Fine Science Tools GmbH, Germany	14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL	CP-Pharma, Germany	115	preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectant	BODE Chemie GmbH, Germany	9803650
Cotton Tipped Applicator sterile	Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany	09-119-9100
Forceps – Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools GmbH, Germany	11253-25
Forceps – straight	Fine Science Tools GmbH, Germany	11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton	Paul Hartmann AG. Germany	401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters	Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probe	Harvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools GmbH, Germany	18000-45
Ketamine 10%	Ecuphar GmbH, Germany	799-760	anesthesia
Magnet	Data Sciences International, United States		transmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter	Fine Science Tools GmbH, Germany	12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710005525	24 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710004020	27 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)	Resorba Medical, Germany	PA10273	lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)	Resorba Medical, Germany	4023	skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope	Zeiss, Germany
Pilca depilatory mousse	Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany	6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%	Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solution	B. Braun Melsungen AG, Germany	401-951
Sensitive plasters, Leukosilk	BSN medical GmbH, Germany	102100	surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesive	SMI, Belgium	ZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)	Resorba Medical, Germany	G2105	lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1	Procter & Gamble
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools GmbH, Germany	18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%	Ecuphar GmbH, Germany	797469	anesthesia
Data acquisition and analysis	Source
DSI Data Exchange Matrix	Data Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI Ponemah	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for mice	Data Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1	Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11	EMKA Technologies		ECG and BP analysis software
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, United States

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Rötzer, R. D., Brox, V. F., Hennis, K., Thalhammer, S. B., Biel, M., Wahl-Schott, C., Fenske, S. Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (168), e62101, doi:10.3791/62101 (2021).

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