Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi
Summary
Kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruz fareler nötrofiller de dahil olmak üzere geniş yayılmış hücre ölümü gösterir. Sitoskeletal lamellipodia’nın bozulması, karmaşık V ATP sintaz alt β birliğinin hücresel ekspresyonunun artması ve bronko-alveoler lavajda anjiyostatin, akciğer immün yanıtının baskılanması ve nötrofil alımının gecikmesi gibi hücresel adaptasyonları gözlemledik.
Abstract
Akciğerler sürekli olarak steril (parçacıklar veya reaktif toksinler) ve enfeksiyöz (bakteriyel, viral veya mantar) enflamatuar durumlar şeklinde doğrudan ve dolaylı hakaretlerle karşı karşıya kalır. Ezici bir konak yanıtı, pato-mantıksal konak immün, pıhtılaştırıcı ve doku remodeling yanıtının bir sonucu olarak akciğer nötrofil alımı ile karakterize olan solunum ve akut akciğer yaralanması ile sonuçlanabilir. Bir TLR4 agonisti olan bakteriyel lipopolisakkarit ile birlikte güçlü bir çevresel kirletici olan düşük doz (0,05 ppm) ozona yanıt olarak, murine akciğer hücresel adaptasyonlarını görselleştirmek ve ölçmek için hassas mikroskobik yöntemler, konakçı enflamatuar ve onarım mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının, akciğer vasküler perfüzyonunun, sol akciğer kriyoseksiyonlarının ve sternal kemik iliğinin perfüzyonunun kapsamlı bir floresan mikroskobik analizini açıklıyoruz. Analiz edilen bölmelerde ayrık kemokin gradyanları ile işaretlenen gecikmiş (36-72 saate kadar) immün yanıt ile korelasyonda alveoler makrofajlar, nötrofiller, akciğer parenkimal dokusunun yanı sıra kemik iliği hücrelerinin hasarını gösteriyoruz. Ek olarak, akciğer hücre dışı matris ve hücresel sitoskeletal etkileşimler (aktin, tubulin), mitokondriyal ve reaktif oksijen türleri, pıhtı önleyici plazminojen, anti-anjiyojenik peptit parçası anjiyostatin, mitokondriyal ATP sintaz kompleks V alt ünlemleri, α ve β sunuyoruz. Bu taşıyıcı belirteçler, yeterli in vitro hücre bazlı tahliller ve intravital mikroskopi gibi in vivo hayvan görüntüleme teknikleri ile desteklendiğinde, yeni immünomodülatör ajanlara akciğer yanıtını anlamaya yönelik hayati bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Akut akciğer hasarı (ALI), pıhtılaştırıcı, fibrinolitik ve doğuştan gelen bağışıklık sistemlerinin eşzamanlı aktivasyonu ile işaretlenen akciğerlerin enfeksiyöz veya diğer zararlı uyaranlara verdiği önemli bir patolojik yanıttır1. Nötrofiller, Toll benzeri reseptör (TLR) ailesi2,3,4aracılığıyla mikrobiyal ve hücre içi hasar kalıplarını derhal algılar. Nötrofiller önceden biçimlendirilmiş sitokinleri ve sitotoksik granül içeriğini serbest bırakır ve bu da daha sonra kollateral doku hasarına neden olabilir. Ortaya çıkan alveolar hasar, adenozin trifosfat (ATP)5gibi moleküllerin salınmasıyla yol açan ikincil hücre ölümü ile gölgelenir, böylece bağışıklık düzensizliğinin kısır bir döngüsüne girer.
ALI’nin anlaşılmasında çözülmemiş bir sorun, yaralanmanın alveolar membran içinde nasıl başlatıldığı sorusuyla ilgilidir. Elektron taşıma kompleksi V, F1F0 ATP synthase, iltihaplanma sırasında hücre (endotel, lökosit, epitel dahil) plazma zarı üzerinde her yerde ifade edildiği bilinen bir mitokondriyal proteindir. Aktin ve tübulin içeren hücre sitoskeleton, sırasıyla mitokondriyal proteinlerin yanı sıra birçok hücre şekli ve fonksiyon modülasyonunu barındırır. Son zamanlarda atp sintaz endojen molekül tarafından abluka göstermiştir, anjiyostatin, nötrofil işe alımını susturur, aktivasyon ve lipopolisakkarit (LPS) indüklenmiş akciğer iltihabı6. Böylece, hem biyokimyasal (ATP sintaz) hem de immün (TLR4) mekanizmalar akciğer iltihabı sırasında alveoler bariyeri düzenleyebilir.
Çevresel bir kirletici olan ozona (O3)maruz kalmak akciğer fonksiyonlarını bozar, pulmoner enfeksiyonlara duyarlılığı arttırır ve kısa düşük O3 maruziyetleri alttaki kardiyorespiratuar koşulları 7 , 8 ,9 ,10,11,12, 13,14olanlarda mortalite riskini arttırır. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili O3 konsantrasyonlarına maruz kalmak, temel inflamasyon mekanizmalarını incelemek için anlamlı bir ALI modeli sağlar7,8. Laboratuvarımız son zamanlarda düşük doz O3 indüklenmiş ALI15bir murine modeli kurmuştur. Düşük O3 konsantrasyonlarına bir doz ve zaman tepkisi yaptıktan sonra, 2 saat boyunca 0.05 ppm O3’e maruz kalmanın, LPS modeline benzer şekilde akciğer ATP sintaz kompleks V alt bir β liği (ATPβ) ve anjiyostatin ekspresyosu ile işaretlenen akut akciğer yaralanmasına neden olduğunu gözlemledik. İntravital akciğer görüntülemesi, akciğer hasarına işaret eden alveolar aktiin mikrofilamentlerinin dağınıklığını ortaya çıkardı, ve alveolar septal reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyelerinin (temel hücre sinyalinin kırılmasını gösteren) ve mitokondriyal membran potansiyelinin (akut hücre ölümünü gösteren) heterojen akciğer 18 FDG tutma16,nötrofil alımı ve sitokin salınımı ile ilişkili olan 0,05 ppm O315’e 2saat maruz kaldıktan sonra ablasyonu, özellikle IL-16 ve SDF-1α. Son çalışmalarımızdan eve götür mesajı, O3’ün insan maruziyeti için 8 saat (günde) üzerinde 0.063 ppm’lik izin verilen sınırların altındaki konsantrasyonlarda maruz kaldığında katlanarak yüksek toksisite ürettiğidir. Daha da önemlisi, bu alt klinik O3 maruziyetlerinin bakteriyel endotoksin17gibi TLR4 aracılı mekanizmaları modüle edip etmeyeceği konusunda net bir anlayış yoktur. Böylece, çift isabetli bir O3 ve LPS maruz kalma modelini inceledik ve immün ve bağışıklık dışı hücresel adaptasyonları gözlemledik.
Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının (yani, BAL) lavajlı akciğer dokusunda kalan yerleşik parankimal ve yapışık lökositlere bakmak için alveolar boşlukları, akciğer damar perfüzyonlarını (yani LVP) örnekleyen akciğer damar perfüzyonu (yani, LVP) endotel bariyerinin tehlikeye girmesi durumunda alveolar septal interstisyumu, sol akciğer kriyoseksiyonlarını örnekleyen , dolaşımdaki lökositleri temsil eden periferik kan ve inflamasyon sırasında hematoetik hücre mobilizasyonunun proksimal ve distal bölgelerini örnekleyen sternal ve femur kemik iliği perfüzyonları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut çalışmada sunulan yöntemler, akciğer iltihabı sırasında birden fazla hücresel olayı incelemek için çoklu bölme analizinin yararlılığını vurgulamaktadır. Bulguları Özetledik Tablo 2. Biz ve birçok laboratuvar, akciğer nötrofillerinin hızlı bir şekilde işe alınmasıyla işaretlenen intranazal LPS aşılamasına verilen murine yanıtı kapsamlı bir şekilde inceledik, bu da 6-24 saat arasında zirve yaptı ve ardından çözünürlük devreye girer. Ve son zamanlarda, al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yapılan araştırma, Başkan’ın NSERC hibesinin yanı sıra Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi’nden başlangıç fonları ile finanse ediliyor. Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi Innovation Saskatchewan tarafından finanse ediliyor. Floresan görüntüleme, NSERC tarafından finanse edilen WCVM Görüntüleme Merkezi’nde gerçekleştirildi. Jessica Brocos (MSc Student) ve Manpreet Kaur (MSc Student), Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi’nin başlangıç fonları tarafından finanse edildi.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
