Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS
Summary
Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.
Abstract
Os pulmões são continuamente confrontados com insultos diretos e indiretos na forma de condições inflamatórias estéreis (partículas ou reativas) e infecciosas (bacterianas, virais ou fúngicas). Uma resposta esmagadora do hospedeiro pode resultar em respiração comprometida e lesão pulmonar aguda, que é caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos pulmonares como resultado da resposta imunológica, coagulativa e remodelagem de tecidos. Métodos microscópicos sensíveis para visualizar e quantificar adaptações celulares pulmonares murinas, em resposta ao ozônio de baixa dose (0,05 ppm), um potente poluente ambiental em combinação com lipopólise bacteriana, um agonista TLR4, são cruciais para entender os mecanismos inflamatórios e de reparo. Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar, perfusato vascular pulmonar, crioseções pulmonares esquerdas e perfusato de medula óssea severa. Mostramos danos de macrófagos alveolares, neutrófilos, tecido parenchímal pulmonar, bem como células de medula óssea em correlação com uma resposta imune retardada (até 36-72 h) que é marcada por gradientes de quimioterapia discretos nos compartimentos analisados. Além disso, apresentamos a matriz extracelular pulmonar e interações citosqueléticas celulares (actina, tubulina), espécies de oxigênio mitocondrial e reativa, plasminogen anticoagulativo, seu fragmento de peptídeo anti-angiogênico angiogenic, as subunidades do complexo de sintetizador ATP mitocondrial V, α e β. Esses marcadores substitutos, quando complementados com ensaios adequados em células in vitro e técnicas de imagem animal in vivo, como microscopia intravital, podem fornecer informações vitais para entender a resposta pulmonar a novos agentes imunomodulatórios.
Introduction
A lesão pulmonar aguda (ALI) é uma resposta patológica crucial dos pulmões a estímulos infecciosos ou outros prejudiciais que é marcada pela ativação simultânea dos sistemas imunológicos coagulativos, fibrinolíticos e inatos1. Os neutrófilos detectam prontamente padrões microbianos, bem como padrões de danos intracelulares através da família receptor toll-like (TLR)2,3,4. Os neutrófilos liberam citocinas pré-formadas e o conteúdo do grânulo citotóxico, que pode causar danos colaterais ao tecido. O dano alveolar resultante é marcado com a morte celular secundária levando à liberação de moléculas como o triptosfato de adenosina (ATP)5, estabelecendo-se assim em um ciclo vicioso de desregulação imunológica.
Um problema não resolvido na compreensão da ALI diz respeito à questão de como a lesão é iniciada dentro da membrana alveolar. O complexo de transporte de elétrons V, g1F0 ATP synthase, é uma proteína mitocondrial conhecida por ser expressa onipresentemente, na célula (incluindo membrana plasmática endotelial, leucócito, epitelial) durante a inflamação. O citoesqueleto celular, composto por actina e tubulina, abriga muitas formas e funções de células modulando, bem como proteínas mitocondriais, respectivamente. Recentemente mostramos que o bloqueio da synthase ATP por uma molécula endógena, angiostatina, silencia o recrutamento de neutrófilos, ativação e lipopólise (LPS) induzida inflamação pulmonar6. Assim, tanto os mecanismos bioquímicos (ATP synthase) quanto os imunológicos (TLR4) podem regular a barreira alveolar durante a inflamação pulmonar.
A exposição ao ozônio (O3),poluente ambiental, prejudica a função pulmonar, aumenta a suscetibilidade a infecções pulmonares, e os baixosníveis curtos de exposições de O 3 aumentam o risco de mortalidade naqueles com condições cardiorrespiratórias subjacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Assim, a exposição a concentrações fisiologicamente relevantes de O3 fornece um modelo significativo de ALI para estudar mecanismos fundamentais de inflamação7,8. Nosso laboratório estabeleceu recentemente um modelo murino de baixa dose O3 induzido ALI15. Após a realização de uma dose e uma resposta ao tempo-resposta às baixas concentrações de O3, observamos que a exposição a 0,05 ppm O3 por 2 h, induz lesão pulmonar aguda que é marcada pela subunidade V do complexo de synthase do pulmão Β (ATPβ) e expressão de angiostatina, semelhante ao modelo LPS. Imagens pulmonares intravitais revelaram a desorganização de microfilamentos de actina alveolar indicando danos pulmonares, e ablação dos níveis de oxigênio reativo septal alveolar (ROS) (indicando revogação da sinalização celular de base) e potencial de membrana mitocondrial (indicando morte celular aguda) após 2 h de exposição a 0,05 ppm O315 que se correlacionava com um pulmão heterogêneo 18retenção FDG16,recrutamento de neutrófilos e liberação de citocinas, liberação, mais notavelmente IL-16 e SDF-1α. A mensagem de nossa última opinião é que O3 produz toxicidade exponencialmente alta quando exposto em concentrações abaixo dos limites permitidos de 0,063 ppm acima de 8h (por dia) para exposição humana. É importante ressaltar que não existe uma compreensão clara sobre se essas exposições sub-clínicas O3 podem modular mecanismos mediados pelo TLR4, como pela endotoxina bacteriana17. Assim, estudamos um modelo de exposição de O3 e LPS de duplo sucesso e observamos as adaptações celulares imunes e não imunes.
Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar (ou seja, BAL) que amostra os espaços alveolares, o perfusato vascular pulmonar (i.e., LVP) que amostra a vasculatura pulmonar e o interstício septal alveolar no caso de uma barreira endotelial comprometida, crioseções pulmonares esquerdas, para olhar para leucócitos parnchímicos e aderentes deixados no tecido pulmonar lavado , sangue periférico que representa os leucócitos circulantes e os perfusados da medula óssea sternal e do fêmur que amostram os locais proximais e distais da mobilização de células hematopoiéticas durante a inflamação, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos apresentados no presente estudo destacam a utilidade da análise de múltiplos compartimentos para estudar múltiplos eventos celulares durante a inflamação pulmonar. Resumimos os resultados na Tabela 2. Nós e muitos laboratórios estudamos extensivamente a resposta murina à instilação intranasal do LPS, que é marcada pelo rápido recrutamento de neutrófilos pulmonares, que atinge o pico entre 6-24 h após o qual, a resolução começa. E recentemente, temos demonstrado que a sub-clí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa realizada é financiada pela subvenção do Presidente NSERC, bem como fundos de start-up do Centro Canadense de Inovação Nuclear Sylvia Fedoruk. O Centro Canadense de Inovação Nuclear De Sylvia Fedoruk é financiado pela Innovation Saskatchewan. A imagem de fluorescência foi realizada no Centro de Imagem WCVM, que é financiado pela NSERC. Jessica Brocos (Estudante de MSc) e Manpreet Kaur (Estudante de MSc) foram financiadas pelos fundos de start-up do Centro Canadense de Inovação Nuclear Sylvia Fedoruk.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
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