הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין
Summary
אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.
Abstract
הריאות מתמודדות ללא הרף עם עלבונות ישירים ועקיפים בצורה של סטרילי (חלקיקים או רעלנים תגובתי) ומצבים דלקתיים זיהומיות (חיידקיות, ויראליות או פטרייתיות). תגובה מארחת מוחצת עלולה לגרום לנשימה נפגעת ופגיעה חריפה בריאות, המאופיינת בגיוס נויטרופילים לריאות כתוצאה מתגובת החיסון, הקרישה ושיפוץ הרקמות של המארח הפתולוגי. שיטות מיקרוסקופיות רגישות כדי לדמיין ולכמת התאמות תאיות ריאות מורין, בתגובה למינון נמוך (0.05 עמודים לדקה) אוזון, מזהם סביבתי רב עוצמה בשילוב עם lipopolysaccharide חיידקי, אגוניסט TLR4, הם חיוניים כדי להבין את המארח דלקתי ומנגנוני תיקון. אנו מתארים ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי מקיף של תאי ריאות ותאי גוף מערכתיים שונים, כלומר נוזל שטיפת הברונכו-מכתשים, זלוף כלי הדם בריאה, קריוסקציות ריאות שמאליות ומח עצם החזה מחלחל. אנו מראים נזק של מקרופאגים מכתשיים, נויטרופילים, רקמת פרמנצ’ימלית ריאות, כמו גם תאי מח עצם בקורלציה עם תגובה חיסונית מושהית (עד 36-72 שעות) המאופיינת על ידי שיפוע כימוקין דיסקרטי בתאים המנותחים. בנוסף, אנו מציגים מטריצה חוץ תאית ריאות ואינטראקציות ציטוסקטליות תאיות (אקטין, טובולין), מיני חמצן מיטוכונדריאליים ומגיבים, פלסמינוגן אנטי-קרישה, אנגיוסטין שבר פפטיד אנטי אנגיוגני שלה, ATP מיטוכונדריאלי קומפלקס V subunits, α β. סמנים פונדקאיים אלה, כאשר בתוספת מבחנים מבוססי תאים במבחנה נאותה וטכניקות הדמיה של בעלי חיים vivo כגון מיקרוסקופיה תוך חיים, יכול לספק מידע חיוני לקראת הבנת תגובת הריאות לסוכנים immunomodulatory הרומן.
Introduction
פגיעה חריפה בריאות (ALI) היא תגובה פתולוגית מכרעת של ריאות לגירויים זיהומיים או מזיקים אחרים אשר מסומן על ידי הפעלה בו זמנית של מערכת חיסונית קרישה, fibrinolytic ו מולד1. נויטרופילים חשים מיד דפוסי נזק מיקרוביאליים, כמו גם תאיים דרך משפחת קולטן דמוי אגרה (TLR)2,3,4. נויטרופילים משחררים ציטוקינים מעוצבים מראש ותכולת גרגירים ציטוטוקסית, אשר לאחר מכן יכול לגרום נזק לרקמות משניות. הנזק מכתש שלאחר מכן הוא נפגם עם מוות תאי משני המוביל לשחרור של מולקולות כגון אדנוזין טריפוספט (ATP)5, ובכך להגדיר במחזור קסמים של dysregulation החיסון.
בעיה בלתי פתורה בהבנת עלי נוגעת לשאלה כיצד הפציעה מתחילה בתוך קרום מכתסם. קומפלקס הובלת האלקטרונים V, F1F0 ATP סינתאז, הוא חלבון מיטוכונדריאלי הידוע להתבטא בכל מקום, על התא (כולל אנדותל, לויקוציטים, אפיתל) קרום פלזמה במהלך דלקת. ציטוסקלטון התא אשר מורכב actin ו tubulin, מטפח צורת תאים רבים ותפקוד אפנון, כמו גם חלבונים מיטוכונדריאליים, בהתאמה. לאחרונה הראינו כי המצור של סינתאז ATP על ידי מולקולה אנדוגנית, אנגיוסטין, משתיק גיוס נויטרופילים, הפעלה lipopolysaccharide (LPS) הנגרמת דלקת ריאות6. לכן, הן ביוכימי (ATP סינתאז) והן מנגנוני החיסון (TLR4) עשויים לווסת את מחסום מכתש במהלך דלקת ריאות.
חשיפה לאוזון (O3), מזהם סביבתי, פוגע בתפקוד הריאות, מגביר את הרגישות לזיהומים ריאתיים, ורמות נמוכות קצרות של חשיפות O3 מגבירות את הסיכון לתמותה אצל אלה עם תנאים קרדיו-ריזפירטוריים בסיסיים7,8,9,10,11,12,13,14. לכן, חשיפה לריכוזים רלוונטייםמבחינה פיזיולוגית של O 3 מספק מודל משמעותי של ALI ללמוד מנגנונים בסיסיים של דלקת7,8. המעבדה שלנו הקימה לאחרונה מודל מורין של Oבמינון נמוך 3 המושרה ALI15. לאחר ביצוע מינון וזמן תגובה לריכוזים נמוכים O3, ראינו כי חשיפה 0.05 עמודים לדקה O3 עבור 2 שעות, גורם לפגיעה ריאות חריפה המסומנת על ידי ריאות ATP סינתאז קומפלקס V subunit β (ATPβ) וביטוי אנגיוסטטין, בדומה לדגם LPS. הדמיית ריאות תוך-וורידית גילתה חוסר ארגון של מיקרופילמנטים מכתש המעידים על נזק לריאות, אבלציה של מינים תגובתיים מחמצת מכתשית (ROS) רמות (המציין ביטול של איתות תאים בסיסי) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (המציין מוות תאי חריף) לאחר 2 h חשיפה 0.05 עמודים לדקה O315 אשר בקורלציה עם ריאה הטרוגנית 18שימור FDG16, גיוס נויטרופילים ושחרור ציטוקינים, בעיקר IL-16 ו SDF-1α. המסר לקחת הביתה מהמחקרים האחרונים שלנו הוא כי O3 מייצר רעילות גבוהה אקספוננציאלית כאשר נחשף בריכוזים מתחת לגבולות המותרים של 0.063 עמודים לדקה מעל 8 שעות (ליום) לחשיפה אנושית. חשוב לציין, אין הבנה ברורה על האם אלה תת קליני O3 חשיפות יכול לווסת מנגנונים בתיווך TLR4 כגון על ידי אנדוטוקסין חיידקי17. לכן, חקרנו מודל חשיפה O3 ו- LPS כפול וראינו את ההתאמות התאיות החיסוניות והלא חיסוניות.
אנו מתארים ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי מקיף של תאי ריאות ותאי גוף מערכתיים שונים, כלומר נוזל שטיפת ברונכו-מכתש (כלומר, BAL) אשר מדגם את החללים מכתשיים, כלי הדם הריאה perfusate (כלומר, LVP) כי דגימות כלי הדם ריאתי ואת interstitium מחיצה מכתשי במקרה של מחסום אנדותל בסכנה, קריוסקציות ריאות שמאל, להסתכל לתוך לויקוציטים parenchymal תושב חסידים שנותרו ברקמת הריאה שטיפת דם היקפי המייצג את הלויקוציטים במחזור ואת מח העצם ועצם הירך perfusates כי מדגם את האתרים הפרוקסימליים והדיסטליים של גיוס תאים hematopoietic במהלך דלקת, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המוצגות במחקר הנוכחי מדגישות את התועלת של ניתוח תאים מרובים כדי לחקור אירועים תאיים מרובים במהלך דלקת ריאות. סיכמנו את הממצאים בטבלה 2. אנחנו ומעבדות רבות חקרנו בהרחבה את התגובה המורינית להטמעת LPS תוך-ענפית, המאופיינת בגיוס מהיר של נויטרופילים לריאות, אשר מגיע לשיאו בין 6-24 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שנערך ממומן על ידי מענק NSERC של הנשיא, כמו גם קרנות הזנק מהמרכז הקנדי סילביה פדורוך לחדשנות גרעינית. המרכז הקנדי לחדשנות גרעינית ע”ש סילביה פדורק ממומן על ידי חדשנות ססקצ’ואן. הדמיית פלואורסצנטיות בוצעה במרכז ההדמיה WCVM, הממומן על ידי NSERC. ג’סיקה ברוקוס (סטודנטית לתואר שני) ומנטורט קאור (סטודנטית לתואר שני) מומנו על ידי קרנות הסטארט-אפ מהמרכז הקנדי לחדשנות גרעינית ע”ש סילביה פדורק.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
