Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel
Summary
Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.
Abstract
Longen worden voortdurend geconfronteerd met directe en indirecte beledigingen in de vorm van steriele (deeltjes of reactieve toxines) en infectieuze (bacteriële, virale of schimmel) ontstekingsaandoeningen. Een overweldigende gastheerreactie kan leiden tot gecompromitteerde ademhaling en acuut longletsel, dat wordt gekenmerkt door long neutrofiele rekrutering als gevolg van de patho-logische gastheer immuun,coagulatieve en weefsel remodellering respons. Gevoelige microscopische methoden om muriene long cellulaire aanpassingen te visualiseren en te kwantificeren, als reactie op lage dosis (0,05 ppm) ozon, een krachtige milieuverontreinigende stof in combinatie met bacteriële lipopolysaccharide, een TLR4-agonist, zijn cruciaal om de ontstekings- en reparatiemechanismen van de gastheer te begrijpen. We beschrijven een uitgebreide fluorescerende microscopische analyse van verschillende long- en systemische lichaamscompartimenten, namelijk de broncho-alveolaire lavagevloeistof, long vasculair perfusaat, linkerlong cryosecties en sternaal beenmergperfusaat. We tonen schade van alveolaire macrofagen, neutrofielen, longparenchymweefsel, evenals beenmergcellen in correlatie met een vertraagde (tot 36-72 uur) immuunrespons die wordt gekenmerkt door discrete chemokinegradiënten in de geanalyseerde compartimenten. Daarnaast presenteren we long extracellulaire matrix en cellulaire cytoskelet interacties (actine, tubuline), mitochondriale en reactieve zuurstofsoorten, anti-coagulatie plasminogen, zijn anti-angiogene peptide fragment angiostatine, de mitochondriale ATP synthase complex V subunits, α en β. Deze surrogaatmarkers, aangevuld met adequate in vitro celgebaseerde assays en in vivo dierbeeldvormingstechnieken zoals intravitale microscopie, kunnen essentiële informatie verschaffen om de longrespons op nieuwe immunomodulerende middelen te begrijpen.
Introduction
Acuut longletsel (ALI) is een cruciale pathologische reactie van de longen op infectieuze of andere schadelijke stimuli die wordt gekenmerkt door gelijktijdige activering van coagulatieve, fibrinolytische en aangeborenimmuunsysteemen 1. Neutrofielen voelen onmiddellijk microbiële en intracellulaire schadepatronen door de Toll-achtige receptor (TLR) familie2,3,4. Neutrofielen geven voorgevormde cytokinen en cytotoxische korrelinhoud vrij, die vervolgens bijkomende weefselschade kunnen veroorzaken. De daaropvolgende alveolaire schade wordt ontsierd met secundaire celdood die leidt tot het vrijkomen van moleculen zoals adenosinetrifosfaat (ATP)5, waardoor een vicieuze cirkel van immuundysregulatie ontstaat.
Een onopgelost probleem in het begrip van ALI heeft betrekking op de vraag hoe de verwonding wordt geïnitieerd binnen het alveolaire membraan. Het elektronentransportcomplex V, F1F0 ATP synthase, is een mitochondriaal eiwit waarvan bekend is dat het alomtegenwoordig wordt uitgedrukt op het plasmamembraan van cellen (inclusief endotheel, leukocyten, epitheel) tijdens ontsteking. Het celcytoskelet dat bestaat uit actine en tubuline, herbergt veel celvorm en functiemodulerende en mitochondriale eiwitten, respectievelijk. We hebben onlangs aangetoond dat blokkade van de ATP-synthase door een endogene molecule, angiostatine, neutrofiele rekrutering, activering en lipopolysaccharide (LPS) veroorzaakte longontstekingdempt 6. Zo kunnen zowel biochemische (ATP synthase) als immuun (TLR4) mechanismen de alveolaire barrière reguleren tijdens longontsteking.
Blootstelling aan ozon (O3), een milieuverontreinigende stof, tast de longfunctie aan, verhoogt de gevoeligheid voor longinfecties en korte lage niveaus van O 3-blootstellingen verhogen het risico opsterfte bij mensen met onderliggende cardiorespiratoire aandoeningen7,8,9,10,11,12,13,14. Blootstelling aan fysiologisch relevante concentraties van O3 biedt dus een zinvol model van ALI om fundamentele ontstekingsmechanismen te bestuderen7,8. Ons lab heeft onlangs een murien model van lage dosis O3 geïnduceerde ALI15. Na het uitvoeren van een dosis en tijdrespons op lage O3-concentraties, merkten we op dat blootstelling aan 0,05 ppm O3 gedurende 2 uur acute longschade veroorzaakt die wordt gekenmerkt door long-ATP-synthasecomplex V-subeenheid β (ATPβ) en angiostatineexpressie, vergelijkbaar met het LPS-model. Intravitale longbeeldvorming onthulde desorganisatie van alveolaire actinemicrofilamenten die wijzen op longschade, en ablatie van alveolaire septale reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus (wat wijst op abrogatie van baseline celsignalering) en mitochondriaal membraanpotentieel (wat wijst op acute celdood) na 2 uur blootstelling aan 0,05ppm O315 die correleerde met een heterogene long18FDG-retentie 16 , neutrofiele werving. De boodschap van onze recente studies is dat O3 exponentieel hoge toxiciteit produceert bij blootstelling aan concentraties onder de toegestane limieten van 0,063 ppm gedurende 8 uur (per dag) voor blootstelling bij de mens. Belangrijk is dat er geen duidelijk begrip bestaat over de vraag of deze subklinische O3-blootstellingen TLR4-gemedieerde mechanismen kunnen moduleren, zoals door bacterieel endotoxine17. Zo bestudeerden we een dual-hit O3- en LPS-blootstellingsmodel en observeerden we de immuun- en niet-immuun cellulaire aanpassingen.
We beschrijven een uitgebreide fluorescerende microscopische analyse van verschillende long- en systemische lichaamscompartimenten, namelijk de broncho-alveolaire lavagevloeistof (d.w.z. BAL) die de alveolaire ruimten, het long vasculaire perfusaat (d.w.z. LVP) bemonstert dat de long vasculatuur en het alveolaire septale interstitium bemonstert in het geval van een aangetaste endotheelbarrière, linker long cryosecties, om te kijken naar ingezeten parenchymale , perifeer bloed dat de circulerende leukocyten en het sternale en dijbeenmerg perfuseert dat de proximale en distale plaatsen van hematopoëtische celmobilisatie tijdens ontsteking bemonstert.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methoden die in de huidige studie worden gepresenteerd, benadrukken het nut van analyse van meerdere compartimenten om meerdere cellulaire gebeurtenissen tijdens longontsteking te bestuderen. We hebben de bevindingen samengevat in tabel 2. Wij en vele laboratoria hebben uitgebreid de muriene respons op intranasale LPS-instillatie bestudeerd, die wordt gekenmerkt door snelle rekrutering van longneutrofielen, die piekt tussen 6-24 uur waarna de resolutie begint. En onlangs hebben we aangetoond dat subkl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het uitgevoerde onderzoek wordt gefinancierd door de NSERC-subsidie van president en startfondsen van het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation wordt gefinancierd door Innovation Saskatchewan. Fluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd in het WCVM Imaging Centre, dat wordt gefinancierd door NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) en Manpreet Kaur (MSc Student) werden gefinancierd door de start-up fondsen van het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
