Изображение подоцитических белков Нефрин, Актин и Подоцин с помощью микроскопии расширения
Summary
Представленный метод позволяет визуализировать флуоресцентно помеченные клеточные белки с расширением микроскопии, что приводит к разрешению 70 нм на обычном микроскопе.
Abstract
Нарушение гломерулярного фильтра, состоящего из гломерулярного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и подоцитов, приводит к альбуминурии. Подоцитные процессы ног содержат актиновые пучки, которые связываются с белками цитоскелетного адаптера, такими как подоцин. Эти адаптерные белки, такие как подоцин, связывают основу диафрагмы гломерулярной щели, такой как нефрит, с актином цитоскелетом. Изучение локализации и функции этих и других подоцитных белков имеет важное значение для понимания роли гломерулярного фильтра в здоровье и болезнях. Представленный протокол позволяет пользователю визуализировать актин, подоцин и нефрит в клетках с визуализацией супер разрешения на обычном микроскопе. Во-первых, клетки окрашиваются с помощью обычной техники иммунофлуоресценции. Все белки в образце затем ковалентно закреплены на опухаемом гидрогеле. Через пищеварение с протеиназой K, структурные белки расщепляются позволяет изотропный отек геля в последний шаг. Диализ образца в воде приводит к 4-4,5-кратное расширение образца и образец может быть изображен с помощью обычного микроскопа флуоресценции, что делает потенциальное разрешение 70 нм.
Introduction
Альбуминурия является суррогатным параметром сердечно-сосудистого риска и является результатом нарушения гломерулярного фильтра1. Гломерулярный фильтр состоит из фенестированного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и щелевой диафрагмы, образованной подоцитами. Первичные и вторичные процессы ног подоцитов обернуть вокруг капиллярной стенки гломерула2. Деликатная структура ног процессов поддерживается корковых актин расслоения, которые также служат в качестве якорей для нескольких белков щели диафрагмы и других белковадаптера 2. Белковый белок разреза диафрагмы называется нефритом и взаимодействует гомофилической манерой с молекулами нефрита противоположных подоцитов. Через различные белки адаптера, нефрит связан с актином цитоскелетом2,3. Мутации в нефрин-кодирующих ген NPHS1 приводят к нефротическому синдрому финского типа4.
Одним из взаимодействующих белков нефрита является подоцин, волосяной белок семьи стоматин3. Подоцин вербует нефрит к липидным плотам и связывает его с актином цитоскелетом5. Подоцин кодируется геном NPHS2. Мутации в NPHS2 приводят к стероидоустойчивому нефротическомусиндрому 6.
Для визуализации и локализации белков адаптера актина могут использоваться методы иммунофлуоресценции. К сожалению, дифракционный барьер света ограничивает разрешение обычных флуоресцентных микроскопов до 200-350 нм7. Новые методы микроскопии, например, стимулировали истощение выбросов (STED)8, фотоактивированная микроскопия локализации (PALM)9, стохастическая оптическая микроскопия реконструкции (STORM или dSTORM) или микроскопия удаления состояния земли с последующим индивидуальным возвращением молекулы (GSDIM)9,10,11, позволяют разрешение до приблизительно 10 нм. Тем не менее, эти методы супер разрешения требуют очень дорогих микроскопов, хорошо обученный персонал и поэтому не доступны во многих лабораториях.
Микроскопия расширения (ExM) является новым и простым методом, который позволяет супер разрешение изображения с обычными микроскопами и потенциально доступна для большого научного сообщества12. В микроскопии расширения удержания белка (proExM) образец интереса (клетки или ткани) фиксируется и окрашивается флюорофорами13. Белки в образце затем covalently якорь небольшой молекулы (6-(((Акрилоил)амино)гексаноиновой кислоты, succinimidyl эстер, AcX) в опухаемыйгидрогель 13. Благодаря энзиматическому пищеварению с протеиназой K (ProK), белки и флюорофоры сохраняют свое относительное положение в геле послерасширения 13. После отеков геля образец расширяется до 4,5 раза (90-кратное расширение объема), что приводит к эффективному боковому разрешению примерно 60-70 нм (300 нм/4,5). Модификации этого метода могут даже позволить 10-кратное расширение (1000-кратное расширение объема), что позволяет разрешение 20-30 нм на обычныхмикроскопах 14,15,16.
Гломекулярные структуры мыши и человеческих почек были визуализированы с помощью ExM17. В этой статье мы представляем подробный протокол proExM для визуализации изображений супер разрешения F-актина и подоцин белка актин-адаптера в клетках с помощью обычного флуоресцентного микроскопа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный метод позволяет исследователю визуализировать клеточные белки, например, подоцин, нефрит и цитоскелетные компоненты, например, F-актин. В рамках этого протокола, трансфицированные cos7 клетки используются в качестве модели для изучения взаимодействия щелевых белков диаф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Бланку Дувняка и Николу Кухра за отличную техническую помощь.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
