拡張顕微鏡によるポドサイクタンパク質のイメージングニーフリン、アクチン、ポドシン
Summary
この提示方法は、従来の顕微鏡で70nmの分解能を導く拡大顕微鏡による蛍光標識された細胞タンパク質の可視化を可能にする。
Abstract
糸球体内皮、糸球体の地下膜およびポドサイトから構成される糸球体フィルターの破壊は、アルブミン尿をもたらす。ポドサイトの足のプロセスは、ポドシンなどの細胞骨格アダプタータンパク質に結合するアクチンバンドルを含む。これらのアダプタータンパク質は、ポドシンなどの、ネフリンなどの糸球体スリットダイヤフラムの骨格をアクチン細胞骨格に連結する。これらのタンパク質および他のポドサイクタンパク質の局在化と機能を研究することは、健康と疾患における糸球体フィルターの役割を理解するために不可欠です。提示された議定書はユーザーが従来の顕微鏡の超解像のイメージ投射と細胞のアクチン、ポドシンおよびネフリンを視覚化することを可能にする。まず、細胞は、従来の免疫蛍光技術で染色される。サンプル内のすべてのタンパク質は、その後、膨らむヒドロゲルに共有結合して固定されます。プロテアーゼKによる消化を通じて、構造タンパク質は切断され、最後のステップでゲルの等熱帯腫脹を可能にする。水中のサンプルの透析はサンプルの4-4.5倍の拡大をもたらし、サンプルは従来の蛍光顕微鏡を介して画像化することができ、70nmの潜在的な解像度をレンダリングする。
Introduction
アルブミン尿症は、心血管リスクの代理パラメータであり、糸球体フィルター1の破壊による結果である。糸球体フィルターは、フェネスト処理された内皮、糸球体の地下膜およびポドサイトによって形成されたスリットダイヤフラムから構成される。ポドサイトの一次および二次足のプロセスは、グロメルラム2の毛細血管壁の周りを包む。足のプロセスの繊細な構造は、複数のスリットダイヤフラムタンパク質および他のアダプタタンパク質のアンカーとしても機能する皮質アクチン束によって維持される2。スリットダイアフラムの骨格タンパク質はネフリンと呼ばれ、反対するポドサイトのネフリン分子と同種的に相互作用する。多様なアダプタータンパク質を介して、ネフリンは、アクチン細胞骨格2、3にリンクされています。ネフリンコード遺伝子NPHS1の変異は、フィンランド型4型のネフローゼ症候群に至る。
ネフリンの相互作用タンパク質の1つは、ストマチンファミリー3のヘアピン様タンパク質であるポドシンである。ポドシンは、脂質ラフトにネフリンを募集し、アクチン細胞骨格5にリンクします。ポドシンは、NPHS2遺伝子によってコードされる。NPHS2の突然変異はステロイド耐性ネフローゼ症候群6につながる。
アクチンアダプタータンパク質を可視化し、共局化するために、免疫蛍光技術が用いられ得る。残念ながら、光の回折障壁は、従来の蛍光顕微鏡の分解能を200〜350nm7に制限する。新規顕微鏡法は、例えば、刺激放出枯渇(STED)8、光活性化局在化顕微鏡(PALM)9、確率的光学再構成顕微鏡(STORMまたはdSTORM)、または個々の分子リターン(GSDIM)9、10、11の後に、約10nmまでの分解能を可能にする。しかし、これらの超分解能技術は、非常に高価な顕微鏡、十分な訓練を受けた人員を必要とし、したがって、多くの研究室では利用できません。
拡張顕微鏡(ExM)は、従来の顕微鏡で超解像度イメージングを可能にする新しい簡単な技術であり、大規模な研究コミュニティ12に潜在的に利用可能である。タンパク質保持拡大顕微鏡(proExM)において、目的とするサンプル(細胞または組織)が固定され、フルオロフォア13で染色される。サンプル中のタンパク質は、その後、小分子((Acryloyl)アミノ酸、コハクニミジルエステル、AcX)によって可膨らむヒドロゲル13に共有結合される。タンパク質および蛍光体は、タンパク質K(ProK)による酵素消化を通じて、膨張後のゲル内での相対的な位置を維持する13。ゲルの腫脹後、サンプルは4.5倍(90倍の容積膨張)まで拡大し、約60-70 nm(300 nm/4.5)の効果的な横解像度に至る。この技術の変更は、10倍の拡張(1,000倍の体積膨張)を可能にし、従来の顕微鏡14、15、16で20〜30nmの解像度をレンダリングする。
マウスとヒト腎臓の糸球体構造は、ExM17を介して可視化されている。本論文では、従来の蛍光顕微鏡を用いて、F-アクチンおよびアクチンアダプタータンパク質ポドシンの超分解能像を細胞内で可視化する詳細なproExMプロトコルを紹介する。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された方法は、研究者が細胞タンパク質、例えば、ポドシン、ネフリン、および細胞骨格成分、例えば、F-アクチンを可視化することを可能にする。このプロトコルでは、トランスフェクトされたcos7細胞がF-アクチンとスリットダイヤフラムタンパク質の相互作用を研究するモデルとして使用されています。残念なことに、不死化ポドサイト細胞株は、スリットダイヤフラムタンパク質<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ブランカ・ドゥヴンジャクとニコラ・クルの優れた技術支援に感謝したいと考えております。
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
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