Imaging di proteine podocitiche Nefrrina, Actina e Podocina con microscopia di espansione
Summary
Il metodo presentato consente la visualizzazione di proteine cellulari etichettate fluorescentmente con microscopia di espansione che porta a una risoluzione di 70 nm su un microscopio convenzionale.
Abstract
L’interruzione del filtro glomerulare composto dall’endotelio glomerulare, dalla membrana basale glomerulare e dai podociti, si traduce in albuminuria. I processi del piede dei podociti contengono fasci di actina che si legano alle proteine dell’adattatore citoscheletricho come la podocina. Queste proteine dell’adattatore, come la podocina, collegano la spina dorsale del diaframma a fessura glomerulare, come la nefrina, all’actina citoscheletro. Studiare la localizzazione e la funzione di queste e di altre proteine podocitiche è essenziale per la comprensione del ruolo del filtro glomerulare nella salute e nelle malattie. Il protocollo presentato consente all’utente di visualizzare actina, podocina e nefrrina nelle cellule con imaging a super risoluzione su un microscopio convenzionale. In primo luogo, le cellule sono macchiate con una tecnica di immunofluorescenza convenzionale. Tutte le proteine all’interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate a un idrogel gonfiabile. Attraverso la digestione con proteinasi K, le proteine strutturali vengono scissa permettendo gonfiore isotropico del gel nell’ultimo passaggio. La dialisi del campione in acqua si traduce in un’espansione di 4-4,5 volte del campione e il campione può essere immaginato tramite un microscopio a fluorescenza convenzionale, rendendo una risoluzione potenziale di 70 nm.
Introduction
L’albuminuria è un parametro surrogato del rischio cardiovascolare e deriva dall’interruzione del filtro glomerulare1. Il filtro glomerulare è composto dall’endotelio fenestrato, dalla membrana basale glomerulare e dal diaframma a fessura formato dai podociti. I processi del piede primario e secondario dei podociti avvolgono la parete capillare del glomerulum2. La delicata struttura dei processi del piede è mantenuta da fasci di actina corticale che fungono anche da ancore per proteine del diaframma a fessura multipla e altre proteine dell’adattatore2. La proteina dorsale del diaframma fessurato è chiamata nefrina e interagisce in modo omofilo con molecole di nefrrina di podociti opposti. Attraverso diverse proteine dell’adattatore, la nefrrina è legata all’actina citoscheletro2,3. Mutazioni nel gene nphrin-codificante NPHS1 portano alla sindrome nefrotica del finlandese di tipo4.
Una delle proteine interagenti della nefrina è la podocina, una proteina simile a una forcina della famiglia delle stomatine3. La podocina recluta nefrrina alle zattere lipidiche e la collega all’actina citoscheletro5. La podocina è codificata dal gene NPHS2. Mutazioni in NPHS2 portano alla sindrome nefrotica resistente agli steroidi6.
Per visualizzare e co-localizzare le proteine dell’adattatore di actina, possono essere utilizzate tecniche di immunofluorescenza. Sfortunatamente, la barriera di diffrazione della luce limita la risoluzione dei microscopi a fluorescenza convenzionali a 200-350 nm7. Le nuove tecniche di microscopia, ad esempio l’esaurimento delle emissioni stimolate (STED)8,la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)9,la microscopia per la ricostruzione ottica stocastica (STORM o dSTORM) o la microscopia a cancellazione dello stato del suolo seguita dal ritorno della singola molecola (GSDIM)9,10,11, consentono una risoluzione fino a circa 10 nm. Tuttavia, queste tecniche di super risoluzione richiedono microscopi molto costosi, personale ben addestrato e quindi non sono disponibili in molti laboratori.
La microscopia di espansione (ExM) è una tecnica nuova e semplice che consente l’imaging a super risoluzione con microscopi convenzionali ed è potenzialmente disponibile per una grande comunità di ricerca12. Nella microscopia di espansione della ritenzione proteica (proExM), il campione di interesse (cellule o tessuti) è fisso e macchiato di fluorofori13. Le proteine all’interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate da una piccola molecola (acido 6-((Acriloil)ammino)esanoico, estere succinimidile, AcX) in un idrogel gonfiabile13. Attraverso la digestione enzimatica con proteinasi K (ProK), proteine e fluorofori mantengono la loro posizione relativa all’interno del gel dopol’espansione 13. Dopo il gonfiore del gel, il campione si espande fino a 4,5 volte (espansione volumetrica di 90 volte) portando ad un’efficace risoluzione laterale di circa 60-70 nm (300 nm/4.5). Le modifiche di questa tecnica possono anche consentire un’espansione di 10 volte (espansione volumetrica di 1.000 volte), rendendo una risoluzione di 20-30 nm sui microscopiconvenzionali 14,15,16.
Le strutture glomerulari del topo e dei reni umani sono state visualizzate tramite ExM17. All’interno di questo documento, presentiamo un protocollo proExM dettagliato per visualizzare immagini a super risoluzione di F-actin e la podocina proteica dell’adattatore actina all’interno delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo presentato consente allo sperimentatore di visualizzare proteine cellulari, ad esempio podocina, nefrrina e componenti citoscheletrici, ad esempio F-actina. All’interno di questo protocollo, le cellule cos7 trasfette sono usate come modello per studiare l’interazione delle proteine del diaframma a fessura con f-actina. Sfortunatamente, le linee cellulari dei podociti immortalate non esprimono quantità endogene sufficienti di proteine del diaframma fessurato19.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Blanka Duvnjak e Nikola Kuhr per l’eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
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